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  新医学  2018, Vol. 49 Issue (11): 781-786  DOI: 10.3969/j.issn.0253-9802.2018.11.003
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洪玉, 刘嘉羿, 彭书崚, 王寿平. Dex预处理对脾切除术后老年大鼠学习记忆能力的影响[J]. 新医学, 2018, 49(11): 781-786.
Hong Yu, Liu Jiayi, Peng Shuling, Wang Shouping. Effect of dexmedetomidine pretreatment on learning and memory function in elderly rats after splenectomy[J]. Journal of New Medicine, 2018, 49(11): 781-786.

基金项目

国家自然科学基金面上项目(81271223)

通讯作者

刘嘉羿, E-mail: 178961893@qq.com

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收稿日期：2018-07-01
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
Dex预处理对脾切除术后老年大鼠学习记忆能力的影响
洪玉 , 刘嘉羿 , 彭书崚 , 王寿平     
510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院麻醉科 （洪玉，刘嘉羿，彭书崚）；510150 广州，广州医科大学附属第三医院麻醉科（王寿平）
收稿日期：2018-07-01
基金项目：国家自然科学基金面上项目(81271223)
通讯作者：刘嘉羿, E-mail: 178961893@qq.com
摘要: 目的 观察右美托咪定(Dex)预处理对脾切除老年大鼠术后学习记忆能力的影响及机制。方法 将健康雄性无特定病原体(SPF)级老年SD雄性大鼠60只按随机数字表法分为对照组、脾切除组和Dex处理组(Dex组)各20只。Dex组大鼠于脾切除手术前30 min经腹腔注射Dex 15 μg/kg, 对照组和脾切除组大鼠腹腔注射等量生理盐水。3组大鼠于术后7 d进行Morris水迷宫试验和旷场试验, 行为学测试完毕后处死大鼠, 检测其海马组织炎性因子IL-1、IL-6、CRP的浓度, 海马淀粉样β蛋白、Tau-Thr181蛋白、磷酸化Tau-Ser356蛋白的表达, 以及海马CA1区细胞凋亡数目, 比较3组的差异。结果 与对照组比较, 脾切除组大鼠平均游泳距离均延长, 探索原平台时间和探索次数缩短/减少(P均＜0.05), 旷场直立次数和跨格次数减少、中央区停留时间均缩短(P均＜0.05);海马组织炎性因子IL-1、IL-6、CRP的浓度均增加(P均＜0.05), 海马组织淀粉样β蛋白, Tau-Thr181蛋白, 磷酸化Tau-Ser356蛋白均增加(P均＜0.05);凋亡阳性细胞数目增加(P＜0.05)。与脾切除组比较, Dex组大鼠平均游泳距离均缩短, 探索原平台时间和探索次数增加(P均＜0.05);旷场直立次数和跨格次数、中央区停留时间均增加(P均＜0.05);海马组织炎性因子IL-1、IL-6、CRP的浓度均减少(P均＜0.05), 海马组织淀粉样β蛋白, Tau-Thr181蛋白, 磷酸化Tau-Ser356蛋白表达均降低(P均＜0.05); Tunnel凋亡阳性细胞数目减少(P＜0.05)。结论 Dex可改善脾切除老年大鼠术后学习记忆能力, 其机制可能与其抑制海马炎性反应及淀粉样β蛋白、磷酸化Tau蛋白的表达, 抑制海马神经元细胞的凋亡有关。
关键词: 右美托咪定    脾切除术    老年大鼠    学习记忆    炎症因子    磷酸化Tau蛋白    淀粉样β蛋白    凋亡    
Effect of dexmedetomidine pretreatment on learning and memory function in elderly rats after splenectomy
Hong Yu, Liu Jiayi, Peng Shuling, Wang Shouping     
Department of Anesthesiology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China
Corresponding author: Liu Jiayi, E-mail:178961893@qq.com
Abstract: Objective To observe the effect and mechanism of dexmedetomidine(Dex)pretreatment on the learning and memory capabilities in elderly rats after splenectomy. Method Sixty healthy SDF-grade aged male SD rats were randomly divided into the control(n=20), splenectomy(n=20)and dexmedetomidine pretreatment groups (Dex group, n=20)using the random number table. In the Dex group, intraperitoneal injection of dexmedetomidine at a dose of 15 μg/kg was administered 30 min before splenectomy, and an equivalent quantity of normal saline was given in the control and splenectomy groups. At postoperative 7 days, the rats were subject to Morris water maze and open field test.The animals were sacrificed after behavioral tests. The hippocampal tissues were immediately removed for the determination of interleukin-1(IL-1)IL-6, C-reactive protein(CRP)using ELISA and the expression of amyloid-β, Tau-Thr181 and phosphorylated Tau-Ser356 proteins by Western blot.TUNEL method was utilized to detect the quantity of apoptotic cells in hippocampal CA1 area. Results Compared with the control group, the average swimming distance was significantly prolonged, the duration and frequency of exploring the original platform were considerably short ened, the number of standing and crossing and the residence time in the central district were significantly shortened in the open field(all P < 0.05). Besides, the expression levels of IL-1, IL-6 and CRPin the hippocampal tissues were significantly up-regulated(all P < 0.05), and the expression levels of amyloid-β, Tau-Thr181 and phosphorylated Tau-Ser356 proteins were considerably up-regulated and the quantity of apoptotic cells was significantly increased in the splenectomy group compared with the control group(all P < 0.05). Compared with the splenectomy group, the average swimming distance was significantly shortened, whereas the duration and frequency of exploring the original platform were considerably increased, the frequency of standing and crossing in the open field was considerably increased the residence time in the central area was significantly prolonged, the concentrations of IL-1, IL-6 and CRPwere significantly decreased, the expression levels of amyloid-β, Tau-Thr181 and phosphorylated Tau-Ser356 proteins in the hippocampus were remarkably down-regulated and the number of apoptotic cells was evidently decreased(all P < 0.05)in the Dex group. Conclusions Dex pretreatment can improve the learning and memory capabilities in the elderly rats after splenectomy, which is probably correlated with inhibiting the inflammatory reaction in the hippocampus, down-regulating the expression of amyloid-β and phosphorylated Tau proteins and suppressing the apoptosis of hippocampal neurons.
Key words: Dexmedetomidine    Splenectomy    Elderly rat    Learning and memory    Inflammatory cytokine    Phosphorylated Tau protein    Amloyid-β protein    Apoptosis    

老年患者发生术后认知功能障碍(POCD)的几率较青中年患者高, POCD使老年患者住院时间延长, 住院费用增加, 生活质量降低[1]。因此研发预防术后POCD的药物已成为热点问题。研究显示中枢炎性反应及Tau蛋白过度磷酸化等在POCD发生发展过程中起重要作用, 但其机制目前尚未完全阐明[2]。右美托咪定(Dex)是一种高选择性的α2肾上腺能受体激动剂, 其具有抗炎及神经保护作用, 被广泛应用于麻醉辅助用药和ICU镇静, 但其能否改善POCD则尚未明确[3]。在本研究中, 笔者旨在观察Dex预处理对小鼠脾切除术后学习记忆能力的影响, 并探讨其作用机制。

材料与方法 一、动物与材料

无特定病原体(SPF)级老年SD雄性大鼠60只, 12月龄, 体质量300~360 g。所有大鼠视觉和运动能力正常, 均由中山大学动物实验中心提供。Dex (江苏恒瑞有限公司), Morris水迷宫(美国Noldus公司), 旷场试验装置(美国Noldus公司), ELISA试剂盒(广州威佳科技有限公司)。Tau-Thr181蛋白试剂盒(批号: #12885, 英国Abcam公司), 淀粉样β蛋白试剂盒(批号: ab2569, 英国Abcam公司)、Tau-Ser356蛋白试剂盒(批号: Abbkine, ABP55175); β-actin (广州晶欣P60709); TUNEL荧光染色试剂盒(美国Promega公司)。本研究实验动物管理及使用符合中山大学实验动物伦理规定。

二、实验分组及模型建立

采用随机数字表法将60只大鼠分为3组:对照组、脾切除组及Dex预处理组(Dex组)各20只。脾切除组与Dex组大鼠麻醉后行脾脏切除术。参照文献[4]将大鼠置于仰卧位固定, 消毒后行腹部正中切口, 长约3 cm, 分离脾脏, 在脾蒂远端根部结扎脾脏动、静脉, 完整摘除脾脏, 对照组大鼠不做特殊处理。Dex组小鼠于术前30 min经腹腔注射Dex 15 μg/kg; 对照组和脾切除组大鼠每日腹腔注射等量生理盐水, 连续7 d。所有大鼠均饲养于SPF级环境中, 房间昼夜周期为12 h, 温度及湿度保持恒定, 大鼠自由觅食。

三、行为学测试 1. 学习记忆能力测试

参照文献[5]的方法进行Morris水迷宫测试, Morris水迷宫为一椭圆形水池(直径150 cm、高50 cm), 维持水温于21~25 ℃。将水池平均分为4个象限, 平台置于第1象限内, 并藏于水下2 cm。按照1~4象限的顺序将大鼠放入水池, 记录大鼠60 s内找到平台的游泳距离, 连续测试4 d。第5日撤除平台, 将大鼠自第3象限放入水池中, 记录60 s内探索原平台象限的时间和穿梭次数。

2. 旷场试验

参照文献[6]的方法进行旷场试验, 旷场箱为4边50 cm的正方形透明玻璃敞箱, 底部平均分为25个方格, 中心的9方格为中心区。记录小鼠15 min内在旷场内的活动情况。

3. ELISA实验测定海马组织炎性因子

完整取出海马组织, 称质量, 于4 ℃匀浆, 低温3 000转/分离心10 min, 离心半径13.5 cm, 取上清液。严格按ELISA试剂盒说明书测定海马IL-1、IL-6及CRP水平, 对比标准曲线读取光密度值。

4. 蛋白免疫印迹法检测海马组织蛋白表达

Tau-Thr181、Tau-Ser356、淀粉样β蛋白测定:取海马组织匀浆, 离心取上清液, 采用Bradford法行蛋白定量。取蛋白样品加1/5体积的5×电泳样品缓冲液加热变性, 以40 μg/泳道上样, 于10%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 将其电转至PVDF膜上。用5%脱脂奶封闭, 先后加入一抗(1: 2 000兔抗Tau-Thr181、1: 2 000兔抗Tau-Ser356抗体、1: 2 000兔抗Aβ抗体、1: 2 000鼠抗β-actin抗体)及羊抗鼠或抗兔的二抗。用DAB显色剂显色, 于暗室压片, 扫描胶片, 用IPP系统进行灰度扫描分析, 以目的蛋白与β-actin灰度值的比值反映蛋白表达水平。

5. TUNEL法检测海马CA1区细胞凋亡情况

石蜡切片脱蜡水化后, 用蛋白酶K工作液(20 mg/L)和平衡缓冲液分别处理10 min, 每个样本滴加50 μl的酶反应液于37 ℃、湿盒中避光孵育60 min。用去离子水终止反应, 避光反应5 min, 抗荧光淬灭封片剂封片。用Olympus倒置荧光显微镜获得海马CA1区200×图像。TUNEL阳性细胞计数采用盲法, 并计算单位面积的阳性细胞数的均值。

四、统计学处理

采用SPSS 19.0处理数据。计量资料以x±s表示, 多组比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果 一、Morris水迷宫测试结果

与对照组比较, 脾切除组平均游泳距离延长, 探索时间缩短, 探索原平台象限次数减少(P均＜0.05), Dex组平均游泳距离、探索时间和探索原平台象限次数差异无统计学意义(P均＞0.05)。与脾切除组比较, Dex组平均游泳距离缩短, 探索时间延长, 探索原平台象限次数增多(P均＜0.05), 见表 1。

表 1 对照组、脾切除组及Dex组大鼠Morris水迷宫实验结果的比较（x±s）
二、旷场试验结果

与对照组比较, 脾切除组旷场中心区停留时间、跨格次数、直立次数减少(P均＜0.05), Dex组旷场中心区停留时间、跨格次数、直立次数差异无统计学意义(P均＞0.05)。与脾切除组比较, Dex组旷场中心区停留时间延长、跨格次数、直立次数增多(P均＜0.05), 见表 2。

表 2 对照组、脾切除组及Dex组大鼠旷场试验结果的比较（x±s）
三、ELISA实验结果

与对照组比较, 脾切除组海马IL-6、CRP、IL-1的含量升高(P均＜0.05), Dex组海马IL-6、CRP、IL-1的含量差异无统计学意义(P均＞0.05)。与脾切除组比较, Dex组海马IL-6、CRP、IL-1的含量降低(P均＜0.05), 见表 3。

表 3 对照组、脾切除组及Dex组海马IL-1、CRP、IL-6含量的比较（x±s）
四、蛋白免疫印迹试验结果

与对照组比较, 脾切除组海马Tau-Thr181、Tau-Ser356、淀粉样β蛋白表达升高(P均＜0.05), Dex组海马Tau-Thr181、Tau-Ser356、淀粉样β蛋白表达差异无统计学意义(P均＞0.05)。与脾切除组比较, Dex组海马Tau-Thr181、Tau-Ser356、淀粉样β蛋白表达降低(P均＜0.05), 见表 4、图 1。

表 4 对照组、脾切除组及Dex组大鼠Tau-Thr181、Tau-Ser356、淀粉样β蛋白表达的比较（x±s）
图 1 蛋白免疫印迹试验结果
五、Tunnel法检测海马神经元凋亡结果

与对照组比较, 脾切除组海马凋亡数目增加(P＜0.05), Dex组海马凋亡数目差异无统计学意义(P＞0.05)。与脾切除组比较, Dex组海马凋亡数目减少(P＜0.05), 见表 5、图 2。

表 5 各组Tunel阳性细胞数目
图 2 Tunnel法检测海马神经元凋亡结果（×200） A：脾切除组；B：Dex组；C：对照组
讨论

POCD是老年患者术后常见的中枢神经并发症, 患者丧失独立生活能力, 严重时可引起阿尔兹海默病, 给患者带来巨大精神及经济负担[7]。因此寻找药物有效预防POCD尤为重要。大脑海马神经元与学习记忆功能密切相关, 其发生炎性反应、氧化应激反应和凋亡与POCD有密切联系[8]。Dex是一种高选择性的α2肾上腺能受体激动剂, 可通过降低炎性因子的表达, 减轻大鼠大脑缺血再灌注损伤; 抑制中枢的交感活性, 调节脑血流和脑氧供, 改善缺血区域的血流灌注, 减少神经细胞的凋亡, 具有神经保护作用, 而其是否可预防POCD有待探讨[9]。

本研究选用12月龄老年大鼠, 是因为其相当于人类老年期, 是研究POCD最合适的年龄段动物模型[10]。同时, 本实验选用水迷宫检测鼠学习记忆功能, 是因为Morris水迷宫实验最为经典, 且可减少感觉和运动缺陷对实验结果的干扰, 能较为客观地反映动物的认知水平[11]。旷场试验是行为学实验中用于评价大鼠在陌生环境中探索行为的重要手段, 其中直立次数和跨格次数的增加反映动物具有探索行为和兴奋性, 中央格停留时间的延长反映动物对新鲜环境的认知能力下降[12]。

本研究结果显示, 脾切除组大鼠游泳距离显著增加, 探索行为显著减少, 而Dex组与对照组无明显差异, 说明Dex可以减轻术后大鼠学习和记忆功能损伤。同时本研究结果发现Dex改善术后学习记忆障碍可能与抑制海马炎性因子IL-1、IL-6、CRP的表达有关。研究表明, 中枢胶质细胞被激活后释放大量IL-1、IL-6等, 引起细胞膜通透性增加, 导致脑水肿, 干扰神经系统, 影响突触的连接功能, 引起中枢神经系统炎性反应, 从而造成认知功能受损[13]。Dex预处理可缓解脑损伤的严重程度, 其原因可能为Dex抑制促炎因子的表达, 调节促炎因子和抗炎因子间的平衡, 减轻全身炎性反应对脑组织的损伤[14]。

同时本研究结果显示, Dex改善大鼠学习记忆功能障碍可能与抑制海马Tau蛋白磷酸化、淀粉样β蛋白的沉积有关。研究者发现海马Tau蛋白过度磷酸化与认知功能减退有关。Tau蛋白和淀粉样β蛋白是阿尔兹海默病的标志性蛋白, 淀粉样β蛋白的沉积引起中枢炎症的级联反应和最终引起的Tau蛋白过度磷酸化可能是引起神经元变性死亡、海马记忆损伤的关键因素[12]。Dex可能通过抑制海马炎性反应的初始环节, 同时降低外周和中枢神经的过度炎性反应, 由此避免淀粉样β蛋白和Tau蛋白的沉积和变性, 从而改善大鼠的认知功能损害[15]。Tunel是常用的检测早期和晚期细胞凋亡的指标, 本研究结果显示, Dex能降低脾切除术后大鼠海马Tunel阳性细胞数, 提示Dex能通过减少大鼠海马神经细胞凋亡而产生神经保护作用。

综上所述, Dex可改善脾切除术后老年大鼠学习记忆能力, 其机制可能与Dex抑制海马炎性反应、淀粉样β蛋白沉积和Tau蛋白磷酸化, 减少海马神经元细胞凋亡有关。

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