复发性自然流产（RSA）是指女性与同一性伴侶发生的2次或2次以上的自然流产，发生率约为1%~5%^[1]。RSA一直是妊娠相关疾病中攻而不克的难题，其中约60%的患者自然流产原因不明，称为原因不明复发性流产（URSA）。既往研究报道半数以上的自然流产，尤其是孕12周前的早期妊娠流产，为胎儿染色体异常导致^[2]。目前，胎儿染色体异常的类型及其产生的原因相关研究较少。近年来，针对流产绒毛组织开展的染色体微阵列分析（CMA）被广泛应用于临床^[3]。CMA对探寻RSA病因和对后续生殖干预的价值一直是争论的焦点问题。为此，本研究收集了因RSA行绒毛CMA的327例患者，探讨流产胎儿染色体核型与母体状况和RSA的关系，现报告如下。

选取2016年1~12月因RSA在我科就诊，并要求行绒毛CMA的患者为研究对象，纳入标准：①既往曾发生2次或以上的孕12周前自然流产；②本次超声确诊胚胎停育或难免流产；③停经45~80 d；④要求行绒毛CMA芯片检测。排除标准：①夫妻双方染色体核型异常；②孕期有明确的感染性疾病病史；③女方有严重的系统性疾病；④合并子宫肌瘤、子宫畸形等子宫异常患者。本研究经武汉大学人民医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署临床研究知情同意书。

Agilent寡核苷酸基因组杂交（CGH）试剂盒，北京博尔城科技全基因组DNA提取试剂盒，QIA-GEN自动DNA提取仪，Thermo CO₂培养箱，Olympus CX31生物显微镜，Cyto Scan HD基因芯片试剂盒及Affymetrix基因芯片杂交仪，Clontech DNA扩增试剂盒。

清宫术后征得患者及其家属书面同意，留取约直径2 cm流产胎儿绒毛组织，用无菌生理盐水漂洗3~5次，48 h内用全基因组DNA提取试剂盒提取DNA，所取DNA经检测浓度与纯度符合标准后置于-20 ℃保存备用。同时将母体外周血2 ml置于EDTA抗凝管，4 ℃保存，使用自动DNA提取仪提取DNA，与绒毛提取DNA进行比对以排除母体污染。

采用美国Affymetric公司的CytoScanHD基因芯片，严格按照说明书进行标准化操作，将提取的绒毛基因组DNA，稀释后取5 μl加入NspⅠ酶消化后，末端补齐后连接上共同引物，PCR扩增纯化，产物通过片段化酶片段化，连接生物素标记，杂交混匀变性后加载于芯片上，置于杂交仪中50 ℃杂交16~18 h，冲洗、染色后扫描，获取数据用于结果分析。

CMA检测结果应用美国Affymatrix公司配套的染色体分析套件（Chas）3.1进行数据归化和结果分析。对在疾病数据库中报道的染色体变异，归为致病性的变异；在正常的染色体多态性数据库中有相符合的染色体变异，归为正常染色体多态性。同时收集患者年龄、孕产史、BMI等资料，根据患者的年龄分为＜35岁组和≥35岁组，根据患者BMI分为＜18.5 kg/m²组、18.5~24.9 kg/m²组和＞24.9 kg/m²组，分别比较不同年龄组及不同BMI组患者的流产胎儿染色体异常率^[4]。

所有数据采用SPSS 18.0分析。经正态性检验后，非正态分布的计量资料用中位数（上、下四分位数）表示；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ²检验。P＜0. 05为差异有统计学意义。

327例RSA患者的年龄19（21，44）岁，自然流产3（2，6）次，有正常妊娠史66例（20.2%），其中45例有早期妊娠人工流产史，有正常分娩史17例，既有人工流产史也有正常分娩史并出现2次以上的自然流产4例。

327例流产胎儿绒毛CMA结果中，正常169例（51.7%），异常158例（48.3%）。158例异常者中，染色体数目异常占84.8%，结构异常占15.2%。染色体数目异常中最多见为三体综合征，其次为X染色单体。染色体结构异常中多见染色体微重复和微缺失，见表 1。

表 1

表 1 158例异常胎儿染色体的类型分布 染色体异常类型 例数（%） 数目异常 134（84.8）   多倍体 17（10.8）     三倍体13例，四倍体4例   三体综合征 89（56.3）     3、5、13号各2例，2、7、11号各3，8号3例，15号9例，22号13例，18号17例，16、21号各16例   45，XO 26（16.5）   21染色体单体 2（1.3） 结构异常 24（15.2）   染色体微缺失 7（4.4）     1、7各2例，22号3例   染色体微重复 15（9.5）     2、8、17、21号各2例，X重复4例，相互嵌合重复3例（6与18、3与X、16与X） 染色体微变异 2（1.3）   15号染色体大片纯合子；1，Yp11.31q11.21各1例

表 1 158例异常胎儿染色体的类型分布

年龄≥35岁的RSA患者胎儿染色体异常率高于年龄＜35岁者（P＜0.01），2组异常染色体分型间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同BMI患者间胎儿染色体异常率及分型比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表 2。

表 2

表 2 不同年龄、BMI的RSA患者间胎儿染色体异常率及分型比较 例（%） 组别 例数 胎儿染色体异常 分型 数目异常 结构异常 年龄＜35岁组 237 101（42.6） 89（88.1） 12（11.9）   ≥35岁组 90 57（63.3） 45（78.9） 12（21.1） χ2值 11.211 P值 ＜0.001 2.379 BMI＜18.5 kg/m2组 27 15（55.6） 11（73.3） 0.123 4（26.7）   18.5~24.9 kg/m2组 234 109（46.7） 94（86.2） 15（13.8）   ＞24.9 kg/m2组 66 34（51.5） 29（85.3） 5（14.7） χ2值 1.119 1.712 P值 0.571 0.425

表 2 不同年龄、BMI的RSA患者间胎儿染色体异常率及分型比较

RSA是难治性的生育障碍，发病率为1%~5%。偶发性自然流产可看作在配子形成及胚胎发育过程出现的随机错误事件，属自然淘汰过程，但2次以上自然流产者的再次妊娠流产发生率上升3倍，3次后再发风险高达80%^[5]。RSA对育龄妇女造成严重的身心伤害，大大增加患者心理和精神负担^[6]。

RSA的病因复杂，半数以上的流产是由于胚胎或胎儿的染色体异常，进行染色体检查非常必要^[7]。2%~5%的夫妇染色体正常，但妊娠后可能产生一个染色体重排的不平衡胚胎，因此双亲染色体核型分析并不能取代胎儿染色体核型分析^[8]。对流产胎儿行染色体检查可以判断流产原因是否为胎儿染色体异常，对RSA夫妇的遗传咨询和指导再次妊娠有重要意义。

Gonzales等^[9]分析了流产胚胎染色体异常类型的频率，结果显示48%的早期自然流产胚胎染色体异常，Huang等^[10]研究报道流产胚胎中染色体非整倍体的发生率是34.7%。本组资料中胎儿异常比例为48.3%，与既往报道相近。

自然流产中的染色体异常80%以上为数目异常，尤其以非整倍体的发生最多见，包括三体、单体及多倍体等^[11]。染色体的非整倍体被认为是造成人类胚胎这种低着床率和早期丢失的一个重要原因。本研究也证实了这一现象，染色体数目异常占84.8%，尤其是各种三体综合征比较多见。三体通常是母体减数分裂中同源染色体不分离，导致子细胞中染色体的重复。本研究中，染色体三体发生率从高至低依次为18、16、21、22、15号，个别次序不同可能是样本量不足的偏倚。X连锁染色体灭活与不明原因RSA有关。胚胎X性染色单体通常是卵子或精子受精过程出现分离错误导致的^[12]。染色体核型为（45，XO）即Turner综合征，是仅次于三体综合征的一类染色体异常，本研究中其发生率为16.5%。常染色体出现单体的情况较少，本研究中仅2例21单体，发生率为1.3%。另一类比较常见的染色体数目异常为多倍体，如三倍体或四倍体，本研究中的发生率为10.8%。三倍体通常是由于双精入卵或卵子在母体减数分裂过程中不分离而直接受精导致，四倍体可能是由于受精卵有丝分裂不分离导致。因为非整倍体流产大多偶然发生，患者预后通常较好，在随后的妊娠中可能获得正常胎儿。反复发生的胎儿异常还可通过胚胎植入前遗传学筛查（PGS）筛选正常胚胎，避免反复流产所致的精神和身体创伤^[13]。

胚胎单纯的染色体数目异常，夫妇再发风险一般相对较低，而染色体结构异常胚胎，往往提示夫妇染色体异常携带可能较大，再发风险也较高^[14-15]。本研究显示，染色体结构异常24例，这种微变异常规染色体核型分析易漏诊，而夫妇可能携带有类似片段异常但未出现相关表型或症状较轻。

孕妇年龄也是胚胎染色体异常的重要因素，随着年龄增加，染色体发生异常风险增加，尤其三体综合征，可能由高龄孕妇卵母细胞暴露于有害环境机会增加，以及卵子老化引起染色体减数分裂不分离现象导致^[16]。本研究显示，年龄≥35岁的RSA患者胎儿染色体异常率高于年龄＜35岁者，说明女性在35岁以后开始出现明显的卵巢老化与卵母细胞分裂异常。本研究亦通过对患者BMI进行分层分析，结果显示BMI＜18.5、18.5~24.9、＞24.9 kg/m²者的胎儿染色体异常率组间比较差异无统计学意义，可能跟样本例数较少有关，值得临床进一步关注。

绒毛细胞是胚胎外胚层细胞，具有与胎儿组织相同的遗传性状，利用绒毛细胞检测胎儿染色体是细胞遗传学研究的主要方法，常用的方法包括G显带染色体核型分析与荧光原位杂交（FISH）等。其中G显带是比较经典传统的方法，费用低廉，可以准确检测流产组织的染色体核型，缺点在于需要对所获得的胎儿绒毛进行细胞培养，无菌要求高，容易污染，尤其是胚胎停育时间较长的流产物，绒毛中活细胞数少，培养失败比例高。G显带染色体核型分析的局限性还在于不能分辨长度在10 Mb以下片断的缺失、重复或易位，而且对染色体亚端粒区域异常诊断率较低，染色体异常漏诊率可高达10%^[17]。FISH通过特异性的探针能够快速诊断染色体数目异常，可大大提高诊断精度，而且对标本要求较低，不仅可以检测处于细胞分裂中期的活细胞，对于细胞间期的无活性或污染的标本也能检测，也无需进行细胞培养。但FISH的缺点是只能利用特异的探针，检测特定的5~12条染色体，不能覆盖全基因组，尤其对背景未知的基因引发的疾病无法检测。其他方法包括基于毛细管电泳检测的荧光定量PCR或多重连接依赖探针扩增等，这些方法仅能针对一定数目的片段进行分析，存在局限性^[18]。

近年发展起来的CMA技术是通过对所有染色体中的基因进行扫描^[19-20]。本研究采用Affymetrix公司的Cyto Scan HD芯片，在高密度优化的单核苷酸多态性（SNP）探针基因分型芯片基础上加入了拷贝数目变异（CNV）探针，同时检测片段的SNP、CNV及杂合性缺失（LOH），不仅能在整个基因组范围内准确地检测出50 kb以上的染色体不平衡，分析嵌合型、三倍体等，还能检测出额外的5%亚微观染色体变异与失衡^[21]。与传统的G显带染色体核型分析和FISH检测相比，CMA技术不仅具有高通量、高分辨率和高自动化检测的优势，还能克服母源污染和培养失败，提高异常核型的检出率，已被我国儿科协会和产前诊断协会分别推荐用于儿科遗传病及产前诊断。值得关注的是，CMA也存在一定的局限性，它无法检测到染色体平衡性重排，也不能检出所有的CNV，如1、9、16及Y染色体次缢痕区域和D组、E组染色体短臂等区域，对于低于检测分辨率的CNV、单基因遗传病的点突变异常、基因表达异常和甲基化异常也无法检出^[22]。把CMA与流式细胞仪、小随体基因分型或与分裂中期FISH相结合，可以弥补CMA技术缺陷，但是费用较高。

Lo等^[23]报道，在常规染色体核型分析正常，但超声发现胎儿结构异常的病例中病理性CNV检出率为6.5 %，高龄孕妇CMA阳性率是1.0%。本研究中有3例检出微缺失，2例检出微变异，占全部异常病例的5.2%。目前对亚微观染色体变异与失衡是否是导致流产直接原因的观点并不一致。有学者认为，这种染色体亚微观变异为单纯多态性，在正常人群中也可发生。多数研究认为，虽然染色体微失衡并不直接改变整个基因编码区，但可能改变涉及区域内覆盖的基因结构，影响基因的表达^[24]。染色体微变异部分还可造成同源染色体配对困难，遗传物质重复或缺少，从而影响细胞分裂，可能是妊娠失败的原因。

染色体数目异常相关的自然流产，与父母双方染色体无关，再发流产风险相对较低；染色体结构异常导致的流产，可能与父母染色体异常携带相关，其再发风险也较高^[25]。因此对于此类型的流产，虽然父母双方常规染色体核型分析正常，仍建议诊断异常片段进行更高精度的染色体结构分析，以评价对后续妊娠可能的影响。本研究显示，大部分染色体异常为数目异常，327例URSA患者中结构异常仅24例，约15.2%，主要包括染色体的微重复、微缺失和微变异，这些异常可能与胚胎停育相关，夫妇可能携带有类似片段异常，由于其遗传外显率不全、表现度差异及性连锁隐性遗传等因素影响而未出现相关表型或症状较轻。

综上所述，RSA患者的胎儿染色体异常率高，对胎儿进行染色体分析对后续的妊娠指导至关重要，胎儿染色体异常大多数为数目异常，流产绒毛组织的CMV具有独特的高分辨率、高灵敏度和特异度，并且能够精确定位，CMV在染色体病的基因型-表型关系诊断具有较高的应用价值。