两肾一夹型肾血管性高血压大鼠模型, 由于其操作相对简单、手术创伤小、造模成功率高, 且能产生显著、稳定的高血压等优点, 在高血压及肾脏疾病的基础研究领域有着广泛的应用。本文通过使用新型的Vevo 2100超声仪, 定量分析两肾一夹型肾血管性高血压大鼠模型造模前后主动脉及肾动脉血流参数, 为造模是否成功提供更全面的依据。

15只健康成年雄性SPF级SD大鼠(生产许可证编号: SCXK (京) 2016-0006), 体质量350~400 g, 购自首都医科大学宣武医院实验动物中心(SYXK (京) 2015-0016), 均以瓶装饮用水及常规固体饲料饲养, 于动物房适应性饲养2周后进行实验。动物实验过程依据3R原则对实验动物给予人道关怀, 且所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。实验通过我院伦理委员会审查(编号201401007)。

Vevo超高分辨率小动物超声实时分子影像系统配备MS-250探头(加拿大Visual Sonics公司); 常规手术器械(上海金钟器械厂); 1/0手术丝线; 钛合金血管夹及施夹器(美国Auto Suture公司); 0.23 mm胰岛素针头(诺和诺德公司); 10%水合氯醛(首都医科大学宣武医院药房自制)。

术前12 h禁食, 以10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后, 腹部使用脱毛膏备皮。碘伏消毒, 酒精脱碘。腹部正中切口, 逐层切开进入腹腔, 取出肠管以生理盐水纱布包裹, 游离左肾静脉显露左肾动脉。在左肾主动脉主干近中点处, 与肾动脉平行衬以直径为0.23 mm的胰岛素针头, 用施夹器夹持钛合金血管夹, 水平位钳夹肾动脉中段及胰岛素针。释放钛夹后, 小心取出胰岛素针头。肠管推送回腹腔, 逐层缝合腹膜、腹白线及皮肤。

造模前后, 分别使用Vevo 2100超高分辨率小动物超声实时分子影像系统配备MS-250探头行血管超声检查。大鼠仰卧位, 探头于中下腹, 二维超声显示大鼠腹主动脉以及左右两侧的肾动脉主干, 叠加彩色多普勒, 以角度 < 60°将取样容积分别置于近肾动脉开口处腹主动脉以及左侧肾动脉狭窄处及远端, 观察彩色血流显像并记录血流流速参数及波形。依次读取3~5个血流频谱对应的血流动力学参数, 取测量数据的平均值。记录肾动脉狭窄处及远端和近肾动脉开口处主动脉的收缩期峰值流速(PSV)和波形, 以及由此产生的肾主动脉比值(RAR)。

造模前与造模14 d后于大鼠清醒状态测量尾动脉收缩压, 将大鼠置于40 ℃环境下, 预热5 min后大鼠于舒适位置固定, 加压袖口引入围绕于大鼠尾根部, 给予充气加压后缓慢下降压力并记录血压。每只鼠连续测量收缩期血压3次, 每次间隔60 s以上, 取3次记录的平均值。

采用SPSS 22.0进行统计分析。正态分布数据以x±s表示, 造模前后数据比较使用配对t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。

造模前肾动脉狭窄处PSV为(383.79±53.20) mm/s, 造模后PSV为(1 061.80±170.42)mm/s, 两者比较差异有统计学意义(t=-16.764, P < 0.001);造模前近肾动脉开口处主动脉PSV为(385.25 ± 39.81) mm/s, 造模后PSV为(379.63±49.81) mm/s, 两者比较差异无统计学意义(t=0.346, P=0.735);造模前肾动脉远端PSV为(400.10±26.70) mm/s, 造模后PSV为(226.51±22.49)mm/s, 两者比较差异具有统计学意义(t=42.457, P < 0.001);造模前RAR为1.00±0.13, 造模后RAR为2.80±0.29, 两者比较差异有统计学意义(t=-23.632, P < 0.001), 见图 1。

图 1

图 1 两肾一夹型肾血管性高血压大鼠模型的超声影像评价 A：肾动脉开口处腹主动脉血流信号；B：肾动脉开口处腹主动脉PSV和血流频谱；C：左肾动脉狭窄处肾动脉血流信号；D：左肾动脉狭窄处PSV和血流频谱；E：左肾动脉远端肾动脉血流信号；F：左肾动脉远端肾动脉PSV和血流频谱

造模前尾动脉收缩压为(117±10) mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa), 造模后14 d上升至(150±9) mm Hg, 造模前、后比较差异有统计学意义(t=-15.515, P < 0.001)。且15只大鼠收缩压升高均在20 mm Hg以上, 高血压模型建立成功, 见图 2。

图 2

图 2 造模前后大鼠尾动脉收缩压变化

肾血管性高血压的动物模型最早源于Goldblatt于1934年进行的经典实验, 实验证实使用血管夹制造狗的一侧肾动脉狭窄之后, 能够产生持续并且稳定的高血压^[1]。在此基础上, 医学研究者如今已广泛使用SD或Wistar大鼠建立肾血管性高血压的动物模型。经过数十年的发展, 当前的造模方式包括两肾一夹法、一肾一夹法、两肾两夹法, 或者通过行腹主动脉缩窄术造成双侧肾脏低灌注诱导高血压动物模型^[2]。两肾一夹法是指制造一侧肾动脉狭窄而对侧肾动脉不做处理, 是研究肾血管性高血压最常用的模型。其优点是操作相对简单、手术创伤小, 动物发生急性心力衰竭、肾衰的可能性较小, 造模成功率高, 并且术后血压升高明显、稳定, 还有机理单纯, 以肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活为主。RAAS被广泛认可和研究, 肾动脉狭窄致肾脏血流量减少, 肾脏缺血, 激活了RAAS, 醛固酮作用于肾脏髓质导致水钠潴留, 血压上升。同时醛固酮也在介导肾脏、心、脑血管损伤的过程中发挥着作用^[3]。另一方面通过激活血管平滑肌AT1受体引起血管收缩, 从而产生继发性高血压^[4]。

以往文献中, 对于两肾一夹法造模成功的鉴定方法, 主要是通过测量造模后的尾动脉收缩压较术前升高的程度来评价, 或是通过肾脏病理学检查观察肾脏缺血性改变^[5-7]。既往文献中因造模中制造肾动脉狭窄的方法不同, 其血压开始升高、达到峰值的时间及血压升高的程度也有所差异。我们的实验于造模前及造模后14 d对动物模型进行血压测量, 其尾动脉收缩压显著升高, 且每只大鼠个体的收缩压均上升20 mm Hg以上, 高血压模型造模成功。但是, 造模术后收缩压何时上升, 上升的程度变异较大, 与大鼠个体差异、环境、造模方法(丝线、血管夹等)相关, 因此尚无一个统一定量的标准; 肾脏病理学的检查, 必须处死动物取材才能进行, 不能实现动态观察, 因此会延长实验周期甚至造成实验失败, 增加实验成本。

血管造影成像技术仍是评价血管病变的"金标准", 但血管造影是有创检查, 行血管造影可能引起造影剂肾病, 对肾血管性高血压后继发的肾脏缺血的病理改变造成影响^[8]。由于上述动脉造影术的局限性, 我们采用Vevo小动物超声系统评价肾动脉狭窄动物模型及狭窄程度。我们使用的高频超声仪器专为实验用小动物设计, 要求麻醉后动物保持绝对的安静状态, 动物固定台移动来耐心寻找合适的切入角度和切入面。目前, 小动物超声技术主要应用于心力衰竭、心肌梗死、动脉损伤等疾病的动物实验研究, 在心腔及瓣膜成像以及血流动力学频谱的清晰度优于临床使用的超声设备, 可以测不同靶血管的血流速度及波形频谱, 提供心血管方面图像及参数^[9-11]。使用Vevo 2100小动物超声技术, 配备超高分辨率的MS-250探头, 造模后检查大鼠模型建立时制造的肾动脉狭窄处血流情况以及肾动脉开口处主动脉流速, 可大大增加两肾一夹型肾血管性高血压大鼠模型的成功率。本研究中造模后肾动脉狭窄处及远端PSV、RAR与造模前比较差异显著。同时, 我们也会检查近肾门处远端肾动脉的流速和波形, 远端出现收缩期峰值流速显著下降和低搏动的波形改变, 也证明了该两肾一夹型肾动脉狭窄大鼠模型的局部肾动脉狭窄程度为重度狭窄, 存在血流动力学改变和远端肾脏实质的血流低灌注。对于使用类似于Vevo高分辨率小动物超声系统评估正常大鼠肾动脉的血流参数既往有相关报道, 但尚无针对两肾一夹法肾血管性高血压动物模型血流参数的报道^[12]。

综上所述, 肾血管性高血压动物模型对研究肾动脉狭窄、缺血性肾病所致高血压的发生机制和病理生理、药物治疗效果等是一种不可缺少的研究工具。Vevo 2100彩色多普勒超声能快速评价两肾一夹型肾血管性高血压大鼠模型是否成功建立, 并且能够动态观察, 准确性高, 值得在动物实验中推广。