染色体异常是出生缺陷的最常见原因之一^[1]。我国每年约有10万例染色体异常患儿出生，出生缺陷成为影响我国人口素质及群体健康水平的公共卫生问题^[2-3]。预防出生缺陷的最有效手段是使用产前筛查与产前诊断干预^{[1, 3-4]}。近年产前诊断模式逐步向减少低危人群的有创检查，提高高危人群的有效检出发展^[5]。目前，我国产前筛查与产前诊断仍以血清学筛查和有创产前诊断为主要方式，但存在假阳性率高与流产风险的问题^[6-7]。随着无创产前基因检测（NIPT）技术的问世与兴起，以其安全、准确、快速等优点迅速受到广泛关注与应用，进一步实现了减少有创检查、提高有效检出的理念。本文就在广东省妇幼保健院接受NIPT检测的23 852例孕妇信息及结果进行回顾性分析，探讨NIPT在产前筛查中的临床应用价值。

选择2015年1月至2017年12月在我院就诊并接受NIPT检测的孕妇。病例纳入标准：孕12周以上，单胎妊娠，符合国家技术规范的适用和慎用标准且自愿接受NIPT检测的孕妇。排除标准：①夫妇一方有明确染色体异常者；②1年内接受过异体输血，移植手术，细胞治疗者；③超声提示胎儿结构异常者；④基因遗传病家族史或胎儿罹患基因病高风险者；⑤母亲孕期合并恶性肿瘤者。剔除临床信息不全与检测失败者，共纳入23 852例孕妇。孕妇年龄15~50岁、中位年龄31岁，孕12~38周、中位孕周22周。检测前告知所有孕妇各项产前诊断方法的临床适应证、局限性及可能存在的风险，经过充分知情选择，孕妇均签署知情同意书。本研究符合伦理标准并通过医院医学伦理委员会的批准。

抽取孕妇外周静脉血8 ml置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管或游离核酸采样管中，4 ℃或室温（无创产前筛查采血管）保存，8 h或3 d（无创产前筛查采血管）内分离血浆。4 ℃、1 600×g离心10 min，留取上层血浆，再以16 000×g离心10 min，最后分装成每管600 μl的血浆于−80℃冰箱保存。

收到标本后采用美国贝克曼Biomek 4000全自动化工作站和博奥晶芯胎儿染色体非整倍体检测试剂盒提取血浆游离DNA及制备文库，具体操作严格按照仪器和试剂盒说明书进行。通过质量检测的文库使用博奥生物BioelectronSeq4000基因测序仪和赛默飞Proton高通量测序平台检测。测序后，通过序列的比对、拼接等生物信息学处理，对不同染色体水平进行统计，识别胎儿染色体是否非整倍体，并通过统计学公式得出胎儿患染色体非整倍体疾病的风险（尤其针对21-、l8-、13-三体综合征）。采用基于二元假设的Z值判断某条染色体是否有拷贝数的异常，主要判断标准：当Z值≥3时，结果提示为非整倍体高风险或重复；当Z值为−2.9~2.9时，结果提示为非整倍体低风险；当Z值≤−3时，提示为单体可能性或缺失。

无创基因检测提示低风险的孕妇，建议在医师指导下定期进行常规产检；无创基因检测提示高风险或缺失或重复的孕妇，建议进一步行羊水或脐血穿刺，通过染色体核型分析结果或染色体微阵列（CMA）结果验证无创结果的准确性。本研究对纳入病例均进行电话随访。结果分析时剔除未产前诊断及失访病例。高风险孕妇随访至有妊娠结局出现，低风险孕妇则随访至新生儿出生后。随访内容包括孕期B超是否异常，孕妇妊娠结局，新生儿体检结果，染色体核型结果（包括羊水脐血或新生儿外周血）。新生儿体检无明显异常者视为正常，新生儿异常、流产、死胎、引产、夭折等则根据出生后体格检查、基因检测结果、B超、病理结果等方面具体分析。

所有计数资料用频数和频率表示。无创结果和核型或CMA结果比较则通过灵敏度、特异度、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）进行评估。灵敏度=真阳性病例数/（真阳性病例数+假阴性病例数），特异度=真阴性病例数/（真阴性病例数+假阳性病例数），PPV=真阳性病例数/（真阳性病例+假阳性病例），NPV=真阴性病例数/（真阴性病例+假阴性病例）。

23 852例行NIPT孕妇的指征构成以血清学筛查临界风险（30.18%）及高风险（26.14%）居多，见表 1。NIPT共检出446例高风险，常见的21-、18-、13-三体综合征占高风险总例数的37.39%（166/444），性染色体异常占23.20%（103/444），缺失或重复占33.78%（150/444），其他染色体三体综合征比例较低，占5.18%。NIPT 446例高风险病例中，血清学合并超声异常或不良孕产史以及超声异常合并不良孕产史者比例较高，见表 2。

表 1

表 1 23 852例孕妇NIPT指征构成比 指征 例数 构成比（%） 单纯高龄 3 135 13.14 血清学筛查高风险 6 378 26.74 血清学筛查临界风险 7 198 30.18 血清学指标异常 1 062 4.45 超声异常 1 196 5.01 不良孕产史 498 2.09 血清学异常合并超声异常 206 0.86 血清学异常合并不良孕产史 474 1.99 超声异常合并不良孕产史 37 0.16 自愿行NIPT 10 0.04 其他 3 658 15.34 合计 23 852 100.00

表 1 23 852例孕妇NIPT指征构成比

表 2

表 2 446例NIPT高风险病例分布情况 例（%） 指征 高风险例数 构成比 高风险占该指标总数比a 21-三体综合征 18-三体综合征 13-三体综合征 性染色体异常 缺失或重复 其他染色体数目异常 多条染色体异常 总计 单纯高龄 70 （15.70） （2.23） 19 5 5 18 18 4 1 70 血清学筛查高风险 171 （38.34） （2.68） 53 21 3 35 51 8 0 171 血清学筛查临界风险 84 （18.83） （1.17） 14 2 3 23 37 4 1 84 血清学指标异常 20 （4.48） （1.88） 1 0 0 10 9 0 0 20 超声异常 29 （6.50） （2.42） 8 0 2 6 10 3 0 29 不良孕产史 6 （1.35） （1.20） 2 0 0 2 2 0 0 6 血清学异常合并超声异常 7 （1.57） （3.40) 4 2 1 0 0 0 0 7 血清学异常合并不良孕产史 13 （2.91） （2.74) 8 2 0 0 3 0 0 13 超声异常合并不良孕产史 2 （0.45） （5.41) 1 0 0 0 0 1 0 2 自愿行NIPT 0 （0.00） （0.00) 0 0 0 0 0 0 0 0 其他 44 （9.87） （1.20) 5 3 4 9 20 3 0 44 合计 446 （100.00） （1.87) 115 35 18 103 150 23 2 446 注：aNIPT检测的高风险例数占该指征的所有例数的百分比

表 2 446例NIPT高风险病例分布情况

446例NIPT高风险孕妇中有226例选择进一步行有创产前诊断，其中经染色体核型分析或CMA确诊异常的共102例，包括21-三体综合征59例、18-三体综合征11例、13-三体综合征4例、性染色体异常18例、染色体缺失或重复9例、其他染色体三体综合征1例。NIPT诊断21-三体综合征的PPV为88.06%，18-三体综合征的PPV为78.57%，13-三体综合征的PPV为33.33%，性染色体的PPV为33.33%，染色体缺失/重复的PPV为15.79%，其他染色体数目异常的PPV为4.76%。21-、18-、13-三体综合征的复合PPV达79.57%，见表 3。

表 3

表 3 226例NIPT高风险病例产前诊断验证结果及确诊病例的妊娠结局 例（%） NIPT高风险类别 进一步诊断例数 确诊例数 PPV 确诊病例妊娠结局 21-三体综合征 67 59 （88.06） 57例引产，1例坚持生下唐氏综合征儿童，1例出生无明显异常 18-三体综合征 14 11 （78.57） 10例引产，1例失访 13-三体综合征 12 4 （33.33） 3例引产，1例出生后夭折 性染色体异常 54 18 （33.33） 11例引产，2例出生无明显异常，5例失访 缺失/重复 57 9 （15.79） 4例引产，4例出生无明显异常，1例失访 其他染色体数目异常 21 1 （4.76） 1例引产 多条染色体异常 1 - - - 总计 226 102 - - 21-、18-、13-复合三体综合征 93 74 （79.57） -

表 3 226例NIPT高风险病例产前诊断验证结果及确诊病例的妊娠结局

未行产前诊断的220例高风险病例中，成功随访了90例，其中出生后体检正常56例（NIPT结果为染色体重复或缺失），出生发现扁平鼻梁1例；因超声异常引产5例；未行产前诊断直接引产共12例，其中1例引产后观察外观正常，8例为流产、胎死宫内或早产夭折，7例拒绝产前诊断但未作说明。

对23 408例无创基因检测筛查中结果为低风险的孕妇进行电话随访，截至2018年4月30日，随访成功15 318例，随访成功率达65.44%。成功随访的低风险孕妇中，出生体检正常14 765例（96.39%）、出生体检异常223例（1.46%）、流产或死产162例（1.06%）、出生后死亡30例（0.20%）；检出染色体异常8例，其中18-三体假阴性（后确诊为18-三体嵌合体）1例，45，X假阴性1例，X染色体2 Mb重复1例，6号染色体8.2 MB缺失1例，9号染色体重复13.5 Mb 1例，21号染色体重复1.26 Mb 1例，10号染色体缺失7.7 Mb 1例，4号染色体18 Mb杂合性缺失1例。NIPT诊断各高风险类别的灵敏度、特异度、NPV见表 4。

表 4

表 4 各种高风险类别的筛查效果评价结果 % 指标 21-三体综合征 18-三体综合征 13-三体综合征 性染色体异常 缺失/重复 其他染色体数目异常 多条染色体异常 灵敏度 100.00 91.67 100.00 90.00 64.29 100.00 - 特异度 99.95 99.98 99.95 99.77 99.69 99.87 - NPV 100.00 99.99 100.00 99.98 99.97 100.00 -

表 4 各种高风险类别的筛查效果评价结果

自1997年香港中文大学卢煜明教授发现了母体外周血中存在胎儿游离DNA，随着新一代测序技术的发展，目前已可使用高通量测序技术检测母体外周血中胎儿游离DNA判断胎儿染色体异常。根据我国NIPT工作开展的经验，国家卫生健康委员会也总结了试点工作经验并结合国内外研究成果制定了我国《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》指导NIPT工作的开展^[8]。本研究显示，血清学筛查临界风险为最常见指征，其次为血清学筛查高风险、单纯高龄和一些其他情况，包括孕期用药、X线接触史、乳腺纤维腺瘤切除术、甲状腺功能异常等。这一结果与既往报道相似^{[3, 9]}。在NIPT推广应用前，血清学筛查高风险和高龄孕妇一般建议行有创产前诊断，抽取羊水、脐血或绒毛做染色体核型分析以确定胎儿染色体情况。虽然介入性产前诊断准确度高，但是容易引起宫内感染、流产等，导致了一部分孕妇依从性差，也增加了孕妇的心理负担。NIPT作为筛查手段中灵敏度最高的技术，可有效减少这部分孕妇的穿刺率^{[5, 10-12]}。因此，越来越多的血清学筛查异常孕妇以及高龄孕妇选择NIPT。

随着NIPT的广泛应用与发展，扩展NIPT检测谱的研究也在逐年增加，但目前临床上仍主要用于检测常见的染色体非整倍体即21-、18-、13-三体综合征^[13]。本研究446例结果异常的孕妇中，常见染色体非整倍体（21-、18-、13-三体综合征）占了37.39%。国内外关于NIPT在常见染色体非整倍体的诊断效能评价有很多，张丽科等^[13]分析了1 207例孕妇的NIPT结果，21-、18-三体综合征灵敏度皆为100%，PPV分别为87.5%和71.43%；罗丽双等^[12]报道了5 756例孕妇NIPT的21-、13-、18-三体综合征及性染色体异常的PPV分别为86%、40%、25%和73%；Petersen等^[14]研究显示，13-、18-、21三体综合征的PPV为45%、76%、84%。本研究中，NIPT诊断21-、18-、13-三体综合征的灵敏度分别为100%、91.67%、100.00%，PPV则为88.06%、78.57%、33.33%。与多数研究结果相近，21-三体综合征的PPV最高，13-三体综合征的PPV较低，可能与样本例数少，13号染色体鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）含量较低导致测序偏差及13-三体综合征孕妇胎盘小，胎儿游离DNA释放较少有关^[15-16]。尽管13-三体综合征PPV偏低，21-、18-、13-三体综合征复合PPV可达79.57%，由此可知，NIPT对21-、18-、13-三体综合征有较好的诊断效能。另外，本研究还分析了NIPT对常见染色体非整倍体以外的其他染色体异常的诊断效能，结果显示对于性染色体异常筛查的灵敏度为90%，特异度为99.77%，PPV为33.33%，NPV为99.98%；对染色体缺失/重复筛查的灵敏度为64.29%，特异度为99.69%，PPV为15.79%，NPV为99.97%；对其他染色体数目异常筛查的PPV只有4.76%，但NPV有100%。可见，NIPT在其他染色体异常检测中准确性不高，但仍有一定的参考价值，排除效果较好。因此，当NIPT提示相关异常时，更应该谨慎咨询，进一步行介入性产前诊断，通过染色体核型和CMA确诊。

虽然NIPT对常见染色体非整倍体的筛查有着较好的检测效能，但是它仍然存在局限性即假阳性和假阴性，本研究也存在假阳性和假阴性的案例。由于无创产前基因筛查检测的并非胎儿自身的DNA，而是由胎盘凋亡释放入母血中的游离DNA，并不能完全代表胎儿本身，且受到多种因素的影响。当母体存在染色体异常、拷贝数变异，母亲患恶性肿瘤，限制性胎盘嵌合，双胎之一停育都会引起无创结果的假阳性^[17]。母血中胎儿游离DNA浓度过低，胎盘正常但是胎儿异常则会导致假阴性的出现。因此，对选择NIPT进行胎儿染色体异常筛查的孕妇，检测前和检测后的咨询工作非常重要，应充分告知孕妇，无创的阳性结果需做进一步确诊，阴性结果仍需结合后续B超检查排除异常^[18]。

综上所述，无创产前基因检测对21-、18-、13三体综合征具有较高的检测效能，但是仍然存在假阳性与假阴性的局限性，仅可作为筛查手段，在临床工作中应做好NIPT检测前和检测后的咨询工作。NIPT在其他染色体异常中准确度不高，如何提高预测的准确度，是我们今后的研究重点。