原发性支气管肺癌（以下简称肺癌）是当今世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率及病死率均高居首位，严重威胁人类生命健康。据统计近年来我国新发肺癌病例数73.33万（男性50.93万，女性22.40万），因肺癌死亡人数达到61.02万（男性43.24万，女性17.78万）^[1]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被认为是真核生物的“细胞能量调节器”，可调节下游通路中与胆固醇代谢、脂肪酸合成及蛋白质合成相关基因的表达，发挥其能量调节器的功能^[2]。近年来的研究表明，激活AMPK信号通路对肿瘤生长和存活有抑制作用。实体肿瘤中，AMPK活性往往较低。Zheng等^[3]研究发现，肝癌中AMPK虽然有表达，但其活性缺失却是一个普遍存在的现象。目前的研究显示AMPK有望成为非小细胞肺癌治疗的靶点，但其具体的分子机制仍需要进一步的探究^[4]。本研究以培养的人A549肺腺癌细胞株为研究对象，外源性给予AMPK激动剂二甲双胍干预细胞，通过MTT、逆转录（RT）-PCR、蛋白免疫印迹法及Transwell等方法研究二甲双胍对人肺腺癌细胞株A549增殖、迁移侵袭以及对microRNA-21（miR-21）水平及其下游PTEN-PI3K/Akt信号通路的影响，旨在为论证激活AMPK作为治疗肺癌的潜在途径提供依据。

人A549肺腺癌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，二甲双胍购自Selleck，Compound C购自Merck Millipore，RNA提取试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司，逆转录试剂盒及TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，PTEN、p-Akt、tAkt、p-AMPK、t-AMPK、GAPDH抗体购自CST，细胞培养板购自Corning，PCR扩增仪及Western电泳仪购自BIO-RAD，MTT试剂购自西唐生物科技有限公司。

A549细胞用含有10%灭活胎牛血清，青霉素（100 U/ml），链霉素（100 μg/ml）的DMEM培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

将处于对数生长期的A549细胞消化贴壁细胞后，加入含10%血清的培养基，制成单细胞悬液并计数，以约6×10³个/孔细胞数接种于96孔培养板中，将培养板放入37℃、5% CO₂培养箱内孵育24 h，细胞全部贴壁后，弃去上清，取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5 mg / ml）20 μl，然后置于37℃、5% CO₂培养箱中继续孵育4 h，弃去上清，每孔加DMSO 150 μl，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；设定空白对照孔调零，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值（OD值）。并计算平均增殖率，增殖率=实验孔OD值/对照孔OD值×100%，整理保存数据。

用RNAfast1000-总RNA极速抽提试剂盒提取细胞总RNA，配制逆转录cDNA反应液用于miR-21及U6的检测，将逆转录好的cDNA稀释10倍至50 ng/μl以下应用BIO-RAD PCR实时定量扩增仪的操作方法进行反应，分析溶解曲线，计算结果。

按实验设计干预细胞后提取蛋白，用BCA法测定蛋白含量、变性，SDS-PAGE电泳，转印后取出硝酸纤维素膜进行免疫反应，膜用滤纸吸干，将预先配制的发光液均匀滴上，BIO-RAD成像系统检测条带，分析结果。

用Matrigel胶与无血清培养基按1:7稀释，每个Transwell小室上加入100 μl稀释液，37 ℃孵育箱孵育Transwell小室至少1 h使胶凝固，制备细胞悬液，在细胞培养箱中常规培养（迁移实验培养24 h，侵袭实验培养48 h），显微镜下取小室的上、下、左、右、中心5个视野部位计数，统计结果。

采用SPSS 18.0统计分析。正态分布数据以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

将A549细胞分为对照组、二甲双胍组，进行Transwell迁移及侵袭试验，结果显示二甲双胍干预后，A549细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制。对穿膜细胞数计数后进行统计分析，组间差异有统计学意义（P < 0.05），见图 1。

图 1

图 1 Transwell实验检测二甲双胍对A549细胞侵袭能力的影响 A：Transwll迁移及侵袭试验；B：2组穿膜细胞数比较

将A549细胞分为对照组及二甲双胍组，提取细胞总蛋白，蛋白免疫印迹法检测各组细胞pAMPK水平，与对照组比较，二甲双胍组p-AMPK水平明显升高（图 2A，P < 0.05）。预先给予AMPK抑制剂Compound C可抑制二甲双胍诱导的p-AMPK水平上调（P < 0.05，图 2B）。MTT检测细胞增殖情况，结果表明特异性抑制AMPK，二甲双胍抑制A549细胞增殖的作用被逆转（图 2C，P < 0.05，与二甲双胍组比较）。

图 2

图 2 二甲双胍通过激活AMPK抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力 A：蛋白免疫印迹法检测二甲双胍激活AMPK；B：蛋白免疫印迹法检测Compound C对二甲双胍激活AMPK的影响；C：MTT检测Compound C对二甲双胍抑制肺癌细胞增殖的影响

预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍抑制A549细胞迁移及侵袭的能力。对穿膜细胞计数后进行统计分析，组间差异有统计学意义（图 3，P < 0.05，与二甲双胍组比较）。

图 3

图 3 Transwell检测Compound C对二甲双胍抑制肺癌细胞侵袭能力的影响 A：Transwell检测Compound C对二甲双胍抑制肺癌细胞侵袭能力的影响；B：3组穿膜细胞数比较

与对照组相比，二甲双胍干预可下调细胞中miR-21水平（P < 0.05），而预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍对miR-21水平的影响（图 4，P < 0.05，与二甲双胍组比较）。

图 4

图 4 激活AMPK抑制miR-21的表达水平

与对照组相比，二甲双胍干预可明显上调细胞中PTEN水平，而预先抑制AMPK可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响；二甲双胍干预可下调A549细胞中p-Akt水平，而预先给予Compound C可以逆转二甲双胍对p-Akt的抑制作用，见图 5。

图 5

图 5 Compound C可以逆转二甲双胍对PTEN、p-Akt的作用 A：蛋白免疫印迹法检测Compound C可以逆转二甲双胍对PTEN的作用；B：蛋白免疫印迹法检测Compound C可以逆转二甲双胍对p-Akt的抑制作用

为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR- 21水平抑制A549细胞增殖。用miR-21 mimics转染A549细胞，培养48 h后提取总RNA，qRT-PCR检测细胞miR-21水平。结果表明miR-21 mimics可明显上调A549细胞中miR-21水平（图 6A，P < 0.05，与对照组比较）。二甲双胍处理可明显抑制A549细胞增殖（P < 0.05，与对照组比较），而预先给予miR -21 mimics可逆转二甲双胍抑制细胞增殖的作用（P < 0.05，与二甲双胍组比较），见图 6B。

图 6

图 6 miR-21介导了激活AMPK抑制肺癌细胞增殖的作用 A：RT⁃PCR检测miR-21 mimics对miR⁃21水平的影响；B：MTT检测miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍抑制A549细胞增殖的作用

为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR- 21水平抑制A549细胞侵袭，将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR-21 mimics +二甲双胍组，Transwell小室实验检测肺癌细胞迁移及侵袭能力。结果表明二甲双胍处理可明显抑制A549细胞迁移及侵袭，而预先给予miR-21 mimics可逆转二甲双胍的抑制作用，对穿膜细胞计数后进行统计分析，组间比较差异有统计学意义（图 7，P < 0.05，与二甲双胍组比较）。

图 7

图 7 Transwell检测miR-21 mimics可逆转二甲双胍抑制A549细胞侵袭能力的作用 A：Transwll迁移及侵袭试验；B：4组穿膜细胞数比较

将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR-21 mimics +二甲双胍组。miRNA mimics NC或miR-21 mimics预转染细胞24 h，然后加入10 ml吡格列酮干预24 h，提取蛋白质，检测PTEN和p-/t-Akt水平。结果显示二甲双胍处理可上调PTEN水平，而预先给予miR-21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响（图 8A）。二甲双胍处理可下调p-Akt水平，而预先给予miR-21 mimics可逆转二甲双胍对p-Akt水平的影响（图 8B）。

图 8

图 8 miR-21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN、P⁃AKT表达水平的影响 A：蛋白免疫印迹法检测miR-21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN表达水平的影响；B：蛋白免疫印迹法检测miR-21 mimics可逆转二甲双胍对P-AKT表达水平的影响

miR-21基因是最早在人类基因组中检测到的miRNA之一，在多种不同类型肿瘤组织中均明显上升，与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、血管生成和抗药性等生物学行为相关，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。近年来，miR-21在肺癌发病和治疗过程中的作用逐渐引起关注^[5-9]。PTEN是miR-21的重要靶蛋白之一，miR-21可以通过下调PTEN水平诱导多种细胞增殖。PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖、迁移、分化、血管生成等一系列病理生理过程。研究表明，Akt可通过磷酸化调控下游靶蛋白的活性或功能^[10-11]。例如，Akt可磷酸化双微基因2蛋白，抑制p53蛋白的功能，促进细胞存活；可通过磷酸化BAD、FXKR抑制其生物活性，抑制细胞凋亡；促进NF-κB磷酸化，抑制细胞凋亡；可通过磷酸化mTOR，上调Skp2水平，下调p27，促进细胞增殖。本研究未系统检测Akt下游关键靶蛋白的活性变化，但大量的研究已建立了它们之间的相关性。

作为肿瘤重要的恶性生物学行为之一，迁移及侵袭加剧了肿瘤的发展进程，影响预后。研究发现在胰腺癌中miR-21表达的上调，加剧了肿瘤细胞的迁移及侵袭^[12]。本研究中，Transwell实验结果证实过表达miR-21可以逆转二甲双胍对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。

综上所述，二甲双胍可通过激活AMPK下调miR-21水平，进而负性调控PTEN-PI3K/Akt信号通路抑制肺癌细胞增殖；此外，二甲双胍还可抑制肺癌细胞的侵袭能力，机制也与激活AMPK，下调miR-21水平有关，提示AMPK可能是防治肺癌的新靶点，但要应用于临床过程，尚需进一步研究、验证。