原发性支气管肺癌(以下简称肺癌)是当今世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率及病死率均高居首位,严重威胁人类生命健康。据统计近年来我国新发肺癌病例数73.33万(男性50.93万,女性22.40万),因肺癌死亡人数达到61.02万(男性43.24万,女性17.78万)[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)被认为是真核生物的“细胞能量调节器”,可调节下游通路中与胆固醇代谢、脂肪酸合成及蛋白质合成相关基因的表达,发挥其能量调节器的功能[2]。近年来的研究表明,激活AMPK信号通路对肿瘤生长和存活有抑制作用。实体肿瘤中,AMPK活性往往较低。Zheng等[3]研究发现,肝癌中AMPK虽然有表达,但其活性缺失却是一个普遍存在的现象。目前的研究显示AMPK有望成为非小细胞肺癌治疗的靶点,但其具体的分子机制仍需要进一步的探究[4]。本研究以培养的人A549肺腺癌细胞株为研究对象,外源性给予AMPK激动剂二甲双胍干预细胞,通过MTT、逆转录(RT)-PCR、蛋白免疫印迹法及Transwell等方法研究二甲双胍对人肺腺癌细胞株A549增殖、迁移侵袭以及对microRNA-21(miR-21)水平及其下游PTEN-PI3K/Akt信号通路的影响,旨在为论证激活AMPK作为治疗肺癌的潜在途径提供依据。
材料与方法 一、细胞株和试剂选择人A549肺腺癌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,二甲双胍购自Selleck,Compound C购自Merck Millipore,RNA提取试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司,逆转录试剂盒及TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司,PTEN、p-Akt、tAkt、p-AMPK、t-AMPK、GAPDH抗体购自CST,细胞培养板购自Corning,PCR扩增仪及Western电泳仪购自BIO-RAD,MTT试剂购自西唐生物科技有限公司。
二、试验方法 1. 细胞培养A549细胞用含有10%灭活胎牛血清,青霉素(100 U/ml),链霉素(100 μg/ml)的DMEM培养基,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
2. 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性将处于对数生长期的A549细胞消化贴壁细胞后,加入含10%血清的培养基,制成单细胞悬液并计数,以约6×103个/孔细胞数接种于96孔培养板中,将培养板放入37℃、5% CO2培养箱内孵育24 h,细胞全部贴壁后,弃去上清,取出96孔板,每孔加入MTT溶液(5 mg / ml)20 μl,然后置于37℃、5% CO2培养箱中继续孵育4 h,弃去上清,每孔加DMSO 150 μl,置于摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解;设定空白对照孔调零,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值(OD值)。并计算平均增殖率,增殖率=实验孔OD值/对照孔OD值×100%,整理保存数据。
3. RT-PCR检测miR-21水平用RNAfast1000-总RNA极速抽提试剂盒提取细胞总RNA,配制逆转录cDNA反应液用于miR-21及U6的检测,将逆转录好的cDNA稀释10倍至50 ng/μl以下应用BIO-RAD PCR实时定量扩增仪的操作方法进行反应,分析溶解曲线,计算结果。
4. 蛋白免疫印迹法检测细胞内PTEN及p-Akt水平按实验设计干预细胞后提取蛋白,用BCA法测定蛋白含量、变性,SDS-PAGE电泳,转印后取出硝酸纤维素膜进行免疫反应,膜用滤纸吸干,将预先配制的发光液均匀滴上,BIO-RAD成像系统检测条带,分析结果。
5. Transwell小室迁移及侵袭实验测定肿瘤细胞迁徙及侵袭能力用Matrigel胶与无血清培养基按1:7稀释,每个Transwell小室上加入100 μl稀释液,37 ℃孵育箱孵育Transwell小室至少1 h使胶凝固,制备细胞悬液,在细胞培养箱中常规培养(迁移实验培养24 h,侵袭实验培养48 h),显微镜下取小室的上、下、左、右、中心5个视野部位计数,统计结果。
三、统计学处理采用SPSS 18.0统计分析。正态分布数据以x±s表示,2组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、二甲双胍抑制肺癌细胞的侵袭能力将A549细胞分为对照组、二甲双胍组,进行Transwell迁移及侵袭试验,结果显示二甲双胍干预后,A549细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制。对穿膜细胞数计数后进行统计分析,组间差异有统计学意义(P < 0.05),见图 1。
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图 1 Transwell实验检测二甲双胍对A549细胞侵袭能力的影响 A:Transwll迁移及侵袭试验;B:2组穿膜细胞数比较 |
将A549细胞分为对照组及二甲双胍组,提取细胞总蛋白,蛋白免疫印迹法检测各组细胞pAMPK水平,与对照组比较,二甲双胍组p-AMPK水平明显升高(图 2A,P < 0.05)。预先给予AMPK抑制剂Compound C可抑制二甲双胍诱导的p-AMPK水平上调(P < 0.05,图 2B)。MTT检测细胞增殖情况,结果表明特异性抑制AMPK,二甲双胍抑制A549细胞增殖的作用被逆转(图 2C,P < 0.05,与二甲双胍组比较)。
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图 2 二甲双胍通过激活AMPK抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力 A:蛋白免疫印迹法检测二甲双胍激活AMPK;B:蛋白免疫印迹法检测Compound C对二甲双胍激活AMPK的影响;C:MTT检测Compound C对二甲双胍抑制肺癌细胞增殖的影响 |
预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍抑制A549细胞迁移及侵袭的能力。对穿膜细胞计数后进行统计分析,组间差异有统计学意义(图 3,P < 0.05,与二甲双胍组比较)。
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图 3 Transwell检测Compound C对二甲双胍抑制肺癌细胞侵袭能力的影响 A:Transwell检测Compound C对二甲双胍抑制肺癌细胞侵袭能力的影响;B:3组穿膜细胞数比较 |
与对照组相比,二甲双胍干预可下调细胞中miR-21水平(P < 0.05),而预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍对miR-21水平的影响(图 4,P < 0.05,与二甲双胍组比较)。
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图 4 激活AMPK抑制miR-21的表达水平 |
与对照组相比,二甲双胍干预可明显上调细胞中PTEN水平,而预先抑制AMPK可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响;二甲双胍干预可下调A549细胞中p-Akt水平,而预先给予Compound C可以逆转二甲双胍对p-Akt的抑制作用,见图 5。
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图 5 Compound C可以逆转二甲双胍对PTEN、p-Akt的作用 A:蛋白免疫印迹法检测Compound C可以逆转二甲双胍对PTEN的作用;B:蛋白免疫印迹法检测Compound C可以逆转二甲双胍对p-Akt的抑制作用 |
为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR- 21水平抑制A549细胞增殖。用miR-21 mimics转染A549细胞,培养48 h后提取总RNA,qRT-PCR检测细胞miR-21水平。结果表明miR-21 mimics可明显上调A549细胞中miR-21水平(图 6A,P < 0.05,与对照组比较)。二甲双胍处理可明显抑制A549细胞增殖(P < 0.05,与对照组比较),而预先给予miR -21 mimics可逆转二甲双胍抑制细胞增殖的作用(P < 0.05,与二甲双胍组比较),见图 6B。
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图 6 miR-21介导了激活AMPK抑制肺癌细胞增殖的作用 A:RT⁃PCR检测miR-21 mimics对miR⁃21水平的影响;B:MTT检测miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍抑制A549细胞增殖的作用 |
为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR- 21水平抑制A549细胞侵袭,将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR-21 mimics +二甲双胍组,Transwell小室实验检测肺癌细胞迁移及侵袭能力。结果表明二甲双胍处理可明显抑制A549细胞迁移及侵袭,而预先给予miR-21 mimics可逆转二甲双胍的抑制作用,对穿膜细胞计数后进行统计分析,组间比较差异有统计学意义(图 7,P < 0.05,与二甲双胍组比较)。
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图 7 Transwell检测miR-21 mimics可逆转二甲双胍抑制A549细胞侵袭能力的作用 A:Transwll迁移及侵袭试验;B:4组穿膜细胞数比较 |
将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR-21 mimics +二甲双胍组。miRNA mimics NC或miR-21 mimics预转染细胞24 h,然后加入10 ml吡格列酮干预24 h,提取蛋白质,检测PTEN和p-/t-Akt水平。结果显示二甲双胍处理可上调PTEN水平,而预先给予miR-21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响(图 8A)。二甲双胍处理可下调p-Akt水平,而预先给予miR-21 mimics可逆转二甲双胍对p-Akt水平的影响(图 8B)。
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图 8 miR-21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN、P⁃AKT表达水平的影响 A:蛋白免疫印迹法检测miR-21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN表达水平的影响;B:蛋白免疫印迹法检测miR-21 mimics可逆转二甲双胍对P-AKT表达水平的影响 |
miR-21基因是最早在人类基因组中检测到的miRNA之一,在多种不同类型肿瘤组织中均明显上升,与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、血管生成和抗药性等生物学行为相关,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。近年来,miR-21在肺癌发病和治疗过程中的作用逐渐引起关注[5-9]。PTEN是miR-21的重要靶蛋白之一,miR-21可以通过下调PTEN水平诱导多种细胞增殖。PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖、迁移、分化、血管生成等一系列病理生理过程。研究表明,Akt可通过磷酸化调控下游靶蛋白的活性或功能[10-11]。例如,Akt可磷酸化双微基因2蛋白,抑制p53蛋白的功能,促进细胞存活;可通过磷酸化BAD、FXKR抑制其生物活性,抑制细胞凋亡;促进NF-κB磷酸化,抑制细胞凋亡;可通过磷酸化mTOR,上调Skp2水平,下调p27,促进细胞增殖。本研究未系统检测Akt下游关键靶蛋白的活性变化,但大量的研究已建立了它们之间的相关性。
作为肿瘤重要的恶性生物学行为之一,迁移及侵袭加剧了肿瘤的发展进程,影响预后。研究发现在胰腺癌中miR-21表达的上调,加剧了肿瘤细胞的迁移及侵袭[12]。本研究中,Transwell实验结果证实过表达miR-21可以逆转二甲双胍对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。
综上所述,二甲双胍可通过激活AMPK下调miR-21水平,进而负性调控PTEN-PI3K/Akt信号通路抑制肺癌细胞增殖;此外,二甲双胍还可抑制肺癌细胞的侵袭能力,机制也与激活AMPK,下调miR-21水平有关,提示AMPK可能是防治肺癌的新靶点,但要应用于临床过程,尚需进一步研究、验证。
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