慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)是慢性鼻窦炎的一种类型，其病理学特征是黏膜慢性炎症和上皮异常的组织重塑，目前已知上皮结构和功能异常包括增生和鳞状化生，常因对其认识不足或治疗不恰当等原因造成控制不佳[1-2]。鼻息肉是一种多因素炎症性疾病，涉及多种细胞信号途径和多种内型[3]。
Hippo-Yes相关蛋白(YAP)信号通路已被证实在细胞增殖、凋亡和分化的调节中起重要作用，并且可以调节发育、器官大小、组织稳态和肿瘤发生[4]。YAP为Hippo通路的主要效应分子，是发育和生理再生过程的关键调节因子，但如果失控，则可以诱导细胞转化和癌症进展[5]。在肺发育过程中，Hippo通路及其核心效应物YAP在气道上皮细胞增殖和分化中起关键作用，提示在鼻息肉上皮中细胞增殖也可能与YAP密切相关[6]。
维替泊芬是一种光敏剂，研究发现维替泊芬作为非光敏剂会抑制YAP基因的转录和翻译，能够在没有光激活的情况下破坏YAP-TEA结构域转录因子(TEAD)相互作用，而且维替泊芬会诱导增殖标志物如Ki-67、c-Myc或参与细胞周期进程的不同细胞周期蛋白表达的丢失，调控细胞增殖和凋亡[7-8]。但目前尚未见维替泊芬作用于人鼻息肉上皮细胞(hNPEC)的报道。本研究旨在探讨YAP和Ki-67在正常鼻黏膜组织和鼻息肉组织中的表达差异，并初步探讨维替泊芬对hNPEC增殖的影响，以期为鼻息肉的治疗提供新的思路。
对象与方法 一、研究对象鼻息肉标本20例纳入鼻息肉组，来自2017年6月至2018年6月期间在我院住院手术治疗的CRSwNP患者，诊断标准严格按照欧洲EPOS[1]。同期住院行鼻中隔偏曲矫正术，因术中暴露解剖结构的需要而切除的正常下鼻甲的10例患者纳入下鼻甲对照组(表 1)。所有患者均需停用全身或口服糖皮质激素至少1个月。排除标准：存在免疫缺陷、凝血功能异常、真菌性鼻窦炎或怀孕的患者。所有患者均已签署知情同意书，并且已获得医院医学伦理委员会同意。
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表 1 鼻息肉组与下鼻甲对照组一般资料比较(x±s) |
采用Trizol试剂提取鼻黏膜组织和hNPEC的总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒将每个样品的总RNA(1 μg)逆转录为cDNA。通过ABI 7500 FAST仪器进行基因表达分析，检测YAP、TEAD、和Ki-67的mRNA水平。使用7500实时PCR系统进行扩增，采用两步法(在95 ℃下预变性30 s，然后在95 ℃下45次扩增5 s，60 ℃下扩增34 s)进行熔解曲线分析，以评价引物的特异性。引物序列见表 2。用2-ΔCT方法计算基因的相对表达量。
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表 2 实时荧光定量PCR引物序列 |
将鼻息肉及下鼻甲组织放入研钵研磨成粉末后，加入适量的裂解液，使用玻璃匀浆器研磨充分后4℃，12 000 g离心5 min，收集上清。按照BCA试剂盒操作说明检测提取的蛋白浓度。充分混匀蛋白样品与上样缓冲液，沸水变性5 min。原代hNPEC用PBS液冲洗3次，用蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解细胞收集总蛋白，将15 μl蛋白在8% SDS-PAGE凝胶中电泳后转移到PVDF膜上。转有蛋白的PVDF膜在5%脱脂牛奶室温封闭1 h，在单克隆抗体稀释液(YAP为1:1 000，Ki-67为1:600，GAPDH为1:3 000)中4 ℃孵育过夜后，在浓度为1:3 000的二抗中室温孵育1 h，TBST清洗后在化学发光法(ECL)发光剂中显影，自动凝胶成像系统采集图像。用Qunatity One软件处理分析条带光密度值，以目的蛋白/内参的比值来表示蛋白的相对表达量。
四、hNPEC体外分离和原代培养新鲜的鼻息肉组织新鲜标本，用含补充青霉素、链霉素和两性霉素的PBS反复冲洗，以清除分泌物和骨头，加入2倍于组织体积的DispaseⅡ酶，4 ℃消化过夜。次日组织悬液用含有0.25% EDTA的胰酶孵育消化15 min，用含10%胎牛血清的1640培养基研磨3次，制成单细胞悬液，在无血清支气管上皮细胞生长培养基(BEGM)中培养7 ~ 10 d，细胞密度达到85% ~ 90%时按实验要求处理细胞。
五、噻唑蓝比色法(MTT)试验hNPEC接种于96孔板，每孔100 μl，细胞数104个/孔，37 ℃培养4 ~ 5 d至细胞贴壁。分3组：对照组不加维替泊芬，不同浓度维替泊芬(0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L)组，每个剂量组合设6个复孔。细胞经维替泊芬处理后，在暗室37 ℃环境下分别温育12、24、48 h，加入5 mg/ml MTT，每孔10 μl，37 ℃温育4 h，每孔加入三联液(SDS 10 g，异丁醇5 ml，10 M HCl 0.1 ml)150 μl，振荡10 min之后37℃过夜，酶标仪检测570 nm处的吸光度(OD)值。实验重复3次，结果取平均值。
六、细胞免疫荧光将hNPEC铺板至24孔板内多聚赖氨酸处理的细胞爬片上，调整细胞数104个/孔，待细胞贴壁后取出使用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗后加入一抗(YAP浓度为1:100，Ki-67浓度为1:800)4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后加入荧光二抗(1:400)37 ℃孵育1 h，PBS冲洗后加入DAPI常温孵育5 min，封固后荧光显微镜下观察拍照。
七、统计学处理所有试验数据采用SPSS 20.0进行分析。正态分布连续性定量资料以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验; 非正态分布定量资料用中位数(上、下四分位数)表示，组间比较用秩和检验。定性资料组间比较采用Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad 7.0软件绘图。
结果 一、Ki-67及YAP在下鼻甲和鼻息肉中的表达实时荧光定量PCR结果显示，下鼻甲(n=10)和鼻息肉(n=20)中均可检测到Ki-67和YAP的mRNA表达，而鼻息肉组Ki-67和YAP的mRNA表达均高于下鼻甲对照组，组间差异有统计学意义(Z= -2.684，P=0.006; Z=-2.090，P=0.035，图 1)。
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图 1 下鼻甲(n=10)与鼻息肉(n=20)中Ki-67和YAP的mRNA表达水平比较 |
同时，蛋白免疫印迹法结果也显示，下鼻甲(n=4)和鼻息肉(n=6)中均可检测到Ki-67和YAP蛋白表达，并且鼻息肉中Ki-67和YAP蛋白的表达均高于下鼻甲对照组，组间差异有统计学意义(t=-2.767，P=0.028;t=-2.454，P=0.040，图 2)。
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图 2 Ki-67和YAP在下鼻甲(n=4)与鼻息肉(n=6)组织中的蛋白表达比较 A、B：Ki-67和YAP检测条带的灰度分析; C：Ki-67和YAP的检测条带 |
采用MTT实验检测维替泊芬是否影响hNPEC的增殖水平。用不同浓度的维替泊芬(0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L)处理hNPEC，分别处理12、24、48 h后予MTT检测。结果表明，维替泊芬以浓度和时间依赖的方式抑制细胞增殖活力(n=3，图 3A)。根据MTT测定结果，维替泊芬处理hNPEC 24 h时的IC50值为2.516±0.246 μmol/L (n=3，图 3B)，后续实验将直接采用维替泊芬的IC50。
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图 3 维替泊芬对hNPEC增殖的影响 A：MTT法(n=3)检测hNPEC的体外增殖活力; B：维替泊芬作用于hNPEC 24 h时的IC50 |
蛋白免疫印迹法结果显示，分别用0、2.516 μmol/L维替泊芬处理hNPEC 24 h后，YAP (t=4.536，P=0.011)及其转录因子TEAD1(t=9.732，P=0.001)，Ki-67(t=4.114，P=0.015)的表达水平降低(n=3，图 4)。
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图 4 维替泊芬对hNPEC Hippo通路相关蛋白表达的影响 A ~ C：Ki-67、YAP和TEAD1检测条带的灰度分析; D：Ki-67、YAP和TEAD1的检测条带 |
免疫荧光实验显示，鼻息肉组织中YAP分布在细胞核和细胞质内，其中主要在核内分布; 2.516 μmol/L维替泊芬处理hNPEC后，Ki-67阳性细胞数减少，而YAP在hNPEC中的定位无明显变化，但核内荧光强度明显降低(图 5)。
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图 5 维替泊芬处理后的hNPEC YAP和Ki-67的荧光染色结果(×400) |
Hippo信号通路在哺乳动物细胞中高度保守，作为Hippo信号转导通道的下游重要转录激活因子，YAP是Hippo通路中的关键蛋白，已被证实调控多种基因的表达，起到调节细胞增殖、凋亡、器官发育和修复等作用[9]。
已有文献证明鼻息肉组织中的上皮细胞增殖率高于正常鼻黏膜[10]。Ki-67核抗体作为评价细胞增殖的预后标志物已广泛使用数十年，鼻息肉重塑的上皮中Ki-67阳性细胞增多[11]。本研究发现与正常下鼻甲黏膜组织相比，YAP在鼻息肉组织中的表达显著增加，同时增殖标志物Ki-67表达上调，提示YAP可能具有促进hNPEC增殖的作用[12]。
作为一种光敏剂，维替泊芬以往被广泛且安全地用于新生血管性黄斑变性以及多种人类肿瘤[13]。近些年来，大量的研究发现维替泊芬作为非光敏激活剂时也有至关重要的治疗作用[14]。本研究的MTT实验结果显示，维替泊芬根据浓度和时间依赖性的方式抑制hNPEC的增殖，并且进一步通过蛋白免疫印迹法和免疫荧光检测Ki-67证实，提示维替泊芬可抑制hNPEC的增殖。
已报道YAP可与多种转录因子结合，包括对细胞发育和癌症进展至关重要的TEAD[5]。一些研究表明YAP作为Hippo通路的核心效应蛋白，通过与TEAD蛋白的相互作用，可以触发靶基因如Areg的转录，从而促进多种肿瘤细胞的增殖[7]。此外，gp130信号通过激活YAP促进肠上皮细胞增殖，导致抵抗黏膜浸润[15]。而维替泊芬可能通过破坏YAP-TEAD复合物和预防YAP诱导的致癌性生长，从而对多种肿瘤生长具有直接抑制作用，这一过程，可以是通过诱导细胞自噬或凋亡，又或者是影响细胞分化[8, 16-21]。在我们的研究中，维替泊芬处理后的hNPEC中YAP、TEAD1和Ki-67的表达明显降低，结果提示维替泊芬对鼻息肉的抑制作用有可能是通过下调YAP、TEAD，从而抑制Ki-67的表达。
综上所述，维替泊芬在体外可以抑制hNPEC的生长和增殖，并且这种细胞生长的抑制可能与YAP-TEAD复合体的干扰相关。YAP可能参与鼻息肉的发病过程，是治疗鼻息肉的潜在靶点。根据本研究结果可推测维替泊芬可以作为鼻息肉的潜在治疗方法。但其具体的作用机制仍需要进一步的深入研究。
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