皮肤癣菌感染导致的浅部真菌病是人类最常见的疾病之一，发病率非常高，累及约20% ~ 25%的世界人口^[1-3]。不仅严重地影响了患者的身心健康而且导致了巨额的医疗支出^[4-6]。其中红色毛癣菌是最主要的致病菌^[7-8]。其感染多呈慢性且极易复发。如何彻底清除红色毛癣菌，避免复发一直是治疗上的一个难题。由于红色毛癣菌感染主要局限于表皮角质层，角质形成细胞对红色毛癣菌的识别是激发皮肤炎症和免疫反应的关键，在机体彻底清除红色毛癣菌的过程中发挥重要作用。本研究构建了新型的红色毛癣菌感染人工表皮模型。并以此模型开展人角质形成细胞应对红色毛癣菌感染的差异表达基因的研究。

人工表皮EpkSkin购自上海斯安诺生物科技有限公司。将人工表皮模型从营养琼脂转移到加有2 ml维持培养基的12孔板里，放入37℃，5.0% CO₂的培养箱里培养过夜，第2日更换培养基用于后续实验。

红色毛癣菌的标准株T1a，由中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC，China Medical Culture Collection，中国医学科学院南京皮肤病研究所）赠予。经过形态学鉴定、内转录间隔区测序和核糖体RNA大亚基D1-D2区序列分析鉴定为红色毛癣菌。

维持培养基购自上海斯安诺生物科技有限公司，马铃薯琼脂糖培养基购于英国Oxoid，氯化钠购自天津市大茂化学试剂场，Whatman滤纸购自英国Whatman。生物安全柜购自江苏苏净集团有限公司，CO₂培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific，超速离心机购自美国贝克曼库尔特。

感染模型的构建参考既往研究成果^[9]。红色毛癣菌T1a接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，27℃培养14 d，连续活化2次以上，每管加入3 ~ 4 ml的0.85%无菌生理盐水，用接种环轻轻刮取菌落表面，收集孢子和菌丝的混合悬液。用11 μm孔径的无菌Whatman滤纸过滤得到孢子悬液。用0.85%无菌生理盐水清洗2次，4 000 rpm，离心10 min，弃去上清液，加适量0.85%无菌生理盐水重悬沉淀的孢子。用细胞计数板进行孢子计数，制成终浓度分别为8×10⁴ cfu/ml的孢子悬液备用。在人工表皮的中央垂直加入5 μl混匀的孢子悬液（400个孢子）构建感染模型，加等量的无菌生理盐水作阴性对照。37℃，5% CO₂培养，每2 d更换维持培养基。

RNA提取：感染后96 h，分离人工表皮，采用Trizol法提取总RNA，随后使用Illumina HiSeq平台进行RNA-seq测序。本研究中采用RPKM（Reads Per Kilobase Millon mapped reads）来表示基因表达量水平，我们采用|log₂ fold change|≥1并且q≤0.05作为筛选差异表达基因的标准。

利用The Go数据库进行Go分析，通过Kegg数据库进行kegg分析，通过String数据库进行蛋白互作（ppi）分析^[10-13]。

在人工表皮受到红色毛癣菌感染后，我们将人工表皮进行RNA-seq分析，RNA-seq结果的热图见图 1。我们共筛选出了1 564个差异表达基因，包括1 102个上调基因与462个下调基因。在这些差异表达基因中我们发现了2个具有抗真菌感染作用的基因即Septin-7（上调了2.6倍）和Annexin-A1（上调了2.4倍）。

图 1

图 1 红色毛癣菌感染人工表皮模型组与阴性对照组2组基因表达的热图

为了了解差异表达基因的功能，我们将差异表达基因进行了Go功能分析，结果具有统计学意义（P < 0.05），见图 2。Go分析结果主要富集于可能与应对红色毛癣菌感染相关的生物学调控、膜及膜组分和催化功能。

图 2

图 2 红色毛癣菌感染后人工表皮角质形成细胞差异表达基因Go分析结果

为了了解差异表达基因所参与的信号通路，我们将差异表达基因进行了kegg分析，结果具有统计学意义（P < 0.05），见图 3。

图 3

图 3 红色毛癣菌感染后人工表皮角质形成细胞差异表达基因的kegg分析 A：通路富集柱状图；B：通路富集气泡图

为了筛选人工表皮角质形成细胞应对红色毛癣菌感染的关键基因，我们将差异表达基因进行ppi分析。PHLPP2和TOP2B这2个基因具有最高度值，可能是角质形成细胞应对红色毛癣菌感染的关键基因，见图 4。

图 4

图 4 PHLPP2与TOP2B分别为核心基因的蛋白互作图 A：PHLPP2为核心的蛋白互作图；B：TOP2B为核心的蛋白互作图

以往主要是通过大鼠、豚鼠等动物感染模型以及角质形成细胞和皮肤癣菌的共培养模型进行皮肤癣菌病发病机制研究^[16-18]。但是对于红色毛癣菌研究以上2种模型都有一定的局限性。首先，红色毛癣菌是典型的亲人性皮肤癣菌，自然条件下极少感染小鼠等实验动物，人类和动物对红色毛癣菌不同的免疫应答被认为是导致红色毛癣菌感染种属差异的重要原因。因此动物感染模型不是研究红色毛癣菌感染免疫机制的最佳选择。其次，普通的共培养模型中红色毛癣菌直接浸泡生长于培养基中和感染人体时主要在角质层中生长不同，因此通过上述模型得出的结论仍有一定的偏差。因此我们采用由人角质形成细胞三维培养形成的人工表皮，感染红色毛癣菌来构建感染模型。此模型中，红色毛癣菌在角质层中侵袭生长，而表皮中的角质形成细胞维持大致正常的形态和结构，完全符合红色毛癣菌感染的病理表现并且很好地克服了由物种差异导致的研究偏差^[9]。

近年来，除本课题组外，还有数个研究通过构建皮肤癣菌感染人工表皮的模型，来开展皮肤癣菌病发病机制的研究。这些研究接种的菌量明显高于我们的研究，模型中大量的菌丝直接侵袭表皮全层，破坏了角质形成细胞结构和形态，这和真实的临床红色毛癣菌感染情况不符，因此我们认为由此类模型得出的研究结果可能有一定的偏差。因为角质形成细胞在受到破坏的情况下，其损伤识别受体可以识别损伤相关分子模式，进而激发一系列继发于角质形成细胞损伤导致的信号通路激活、炎症因子分泌。干扰角质形成细胞针对红色毛癣菌感染原发免疫相关机制的研究。

我们共筛选出了1 564个差异表达基因，包括1 102个上调基因与462个下调基因。在这些差异表达基因中上调基因占大多数，而下调基因只占少部分，这反映人工表皮角质形成细胞可能上调某些基因来应对红色毛癣菌的感染。有研究表明Septin-7可以在内皮细胞中形成内吞白假丝酵母菌的复合物^[14]。Annexin-A1表达于口腔上皮细胞，在正常条件下具有抗白假丝酵母菌感染功能^[15]。在这些差异表达基因中我们发现了2个具有抗真菌感染作用的基因Septin-7和Annexin-A1，Septin-7上调了2.6倍，Annexin-A1上调了2.4倍，说明它们可能在应对红色毛癣菌感染中具有重要的作用。

我们通过感染模型的构建以及RNA-seq分析，得到了人角质形成细胞在应对红色毛癣菌感染的差异表达基因数据，再通过Go、kegg以及ppi分析了解这些差异表达基因的功能。差异表达基因主要富集于赖氨酸降解、磷酸肌醇代谢以及大肠肿瘤相关通路。目前还没有研究表明这些通路与抗真菌感染直接相关。值得注意的是，富集的通路中并没有免疫通路，这可能说明了人角质形成细胞识别红色毛癣菌产生免疫应答的能力不足，符合临床上红色毛癣菌感染炎症轻微的特性。

值得注意的是，ppi分析中2个度值最高的基因PHLPP2和TOP2B可能在角质形成细胞应对红色毛癣菌感染中扮演着重要的作用。据报道，抑制PHLPP2的表达会导致c-JUN的激活，并最终提升TNF-α的表达水平^[19]。

综上所述，深入研究人角质形成细胞应对红色毛癣菌感染的基因表达差异，对于探究皮肤癣菌发病机制以及开发更有效的皮肤癣菌病防治药物和方法都显得尤为重要。