地中海贫血（地贫）是一种严重威胁人类健康的遗传性溶血疾病，由珠蛋白基因的缺失或者位点突变造成[1-2]。地贫分为α型、β型、δβ型和δ型，其中以α和β地贫较为常见。血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，含有4条多肽链，每条多肽链含有1个血红素基团。组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链。α珠蛋白由α1珠蛋白基因HBA1和α2珠蛋白基因HBA2编码，β珠蛋白由β珠蛋白基因（HBB）编码，γ珠蛋白由HBG1和HBG2基因编码，δ珠蛋白由HBD基因编码。血红蛋白具有多种类型，包括血红蛋白A（HbA，α2β2）、血红蛋白A2（HbA2，α2δ2）、血红蛋白F（HbF、α2γ2）、血红蛋白H（HbH、β4）、血红蛋白HbBart’s（γ4）。福建省龙岩市是地贫的高发地区，本研究将对该地区地贫患者的α珠蛋白基因和β珠蛋白基因进行测序检测，进一步了解突变类型及分布，现报告如下。
对象与方法 一、研究对象选择福建省龙岩市15例地贫筛查阳性患者，其红细胞平均体积（MCV） < 80 fl和（或）红细胞平均血红蛋白含量（MCH） < 27 pg。15例地贫患者男6例、女9例，年龄11 ~ 71岁、中位年龄41岁，均非同一家系。所有受试者或其家属已签署知情同意书，本研究已通过福建医科大学附属龙岩第一医院医学伦理委员会审批。
二、方法 1. 主要试剂包括：HiPure Tissue DNA Mini Kit（美基生物），琼脂糖（西班牙Biowest），EB（上海阿拉丁生化科技有限公司），2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技术有限公司），TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司），根据人类11号染色体的序列（NC_000011.10）和16号染色体的序列（NC_000016.10）设计的引物由苏州鸿迅生物科技有限公司合成，其序列见表 1。
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表 1 引物序列及产物长度 |
包括：XS-800i全自动血液分析仪（日本SYSMEX株式会社），Nano-300微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司），Powerpac Basic电泳仪（美国Bio-RAD），Tanon-1600凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），A100PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司），CAPILLARYS2全自动毛细管电泳仪（法国Sebia）。
3. 标本采集采集每例地贫筛查阳性患者的外周血约5 ml，置于BD K2EDTA常规采血管（BD Becton，367856）备用。
4. 血常规分析将2 ml外周血轻轻颠倒30次以上进行混匀，进样，测定血红蛋白水平、MCV、MCH等参数。
5. DNA提取按照试验盒说明书中的操作方法提取血液中的DNA。检测DNA的浓度，并且用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和片段大小。
6. 缺失型突变的跨越裂口PCR（Gap-PCR）法检测PCR反应体系包括7.5 μl 2×Power Taq PCR MasterMix、0.6 μl 10 μmol/L上游引物、0.3 μl 10 μmol/L野生型下游引物、0.3 μl 10 μmol/L突变体下游引物、50 ng DNA，最后以超纯水补足至15 μl。反应条件：98 ℃预变性1 min，98℃变性10 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。用SEA-F、SEA-WR和SEA-MR引物检测--SEA，用3.7-F、3.7-WR和3.7-MR引物检测-α3.7，用4.2-F、4.2-WR和4.2-MR引物检测-α4.2。
7. 目标基因的PCR扩增PCR反应体系包括：10 μl 5×TransStart FastPfu Fly buffer，4 μl 2.5 mmol/L dNTPs、1 μl 10 μmol/L上游引物、1 μl 10 μmol/L下游引物、200 ng DNA、1 μl TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase，最后以超纯水补足50 μl。反应条件：98℃预变性1 min，98 ℃变性10 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。用HBA1-F和HBA1-R引物扩增HBA1基因，用HBA2-F和HBA2-R引物扩增HBA2基因，用HBB-F和HBB-R引物扩增HBB基因。将所有的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
8. PCR产物的测序电泳检测目标基因的PCR产物后，将目标PCR条带切出，委托广州艾基生物有限公司进行测序检测。HBA1基因PCR产物的测序引物是HBA1-F和HBA1-R，HBA2基因PCR产物的测序引物是HBA2-F和HBA2-R，HBB基因PCR产物的测序引物是HBB-F、HBB-R和HBB-ceR。
9. 蛋白质三维结构模拟应用SWISS-MODEL网站（https://swissmodel.expasy.org/）模拟蛋白质的三维结构。
10. 血红蛋白毛细管电泳将抗凝血液200×g离心5 min，去除上层血浆，取50 μl红细胞加入试管中。把装有红细胞的试管按顺序放在仪器配套的检测架上，在检测架最后的位置加入约4 ml溶血试剂。把检测架送入毛细管电泳仪进行血红蛋白电泳检测，约30 min后检测程序完毕，查看结果。
结果 一、15例地贫筛查阳性患者的血常规检测结果15例地贫筛查阳性患者血红蛋白64~125 g/L，MCV 54.0~85.1 fl，MCH 14.9~25.5 pg，详见表 2。
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表 2 15例地贫筛查阳性患者的血常规检测结果 |
15例地贫患者中，检测到--SEA缺失7例、-α3.7缺失4例、-α4.2缺失1例；共检测到23种点突变类型，包括10种新位点突变，分别是HBA1: codon 14 TGG > TGA、HBA1: IVS-Ⅰ-65A > G、HBA1: codon 139 AAA > ATA、HBA2: -43 G > C、HBA2: c.*136 A > G、HBB: -99 G > A、HBB: -96 G > A、HBB: -62 G > A、HBB: c.56 C > T和HBB: 3’UTR +133 G > C。我国南方非缺失型α地贫主要是Hb Constant Spring (Hb CS)和Hb Quong Sze (Hb QS) [3]。然而，从15例地贫患者中检测到4例（27%）HBA1: codon 14 TGG > TGA突变（4例HBA1: codon 14TGG > TGA杂合突变体），仅检测到3例Hb Constant Spring突变和1例Hb Quong Sze突变，因此HBA1: codon 14 TGG > TGA在福建省龙岩市很可能是一种常见的α地贫突变。检测出的已知引起β地贫的位点突变有4种，分别是codon 17 (A- > T)、codons 41/42 (-TTCT)、codon 43 (G- > T)和IVS-Ⅱ-654 (C- > T)[4]。排除缺失，所有的α2珠蛋白基因均具有HBA2: -43 G > C、alpha2 +832 G- > A和HBA2: c.*136A > G突变。
三、α1珠蛋白基因的3种新位点突变分析HBA1: codon 14 TGG > TGA是α1珠蛋白基因第14密码子突变成终止密码子（图 1A）。已报道的α1珠蛋白基因第14密码子变成终止密码子的突变Codon 14 G > A是TGG突变成TAG，与HBA1: codon 14 TGG > TGA不同[4]。HBA1: IVS-Ⅰ-65A > G是α1珠蛋白基因第1个内含子中第65碱基由A突变成G（图 1B）。HBA1: IVS-Ⅰ-65A > G的携带者同时具有造成β地贫的IVS-Ⅱ-654 (C- > T)杂合突变，因此尚未确定HBA1:IVS-Ⅰ-65A > G是否造成α地贫[5]。HBA1: codon 139 AAA > ATA是α1珠蛋白基因第139密码子由AAA突变成ATA，导致α珠蛋白第139氨基酸由赖氨酸突变成异亮氨酸（图 1C）。α珠蛋白由141个氨基酸构成，该突变位于α珠蛋白的羧基端，不影响α珠蛋白的空间结构（图 2，野生型α珠蛋白https://swissmodel.expasy.org/interactive/4wK8AW/models/，139赖氨酸 > 异亮氨酸α珠蛋白https://swissmodel.expasy.org/interactive/9UYAqd/models/）。
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图 1 α1珠蛋白基因新位点突变测序图 A：HBA1: codon 14 TGG > TGA；B：HBA1: IVS-Ⅰ-65 A > G；C：HBA1: codon 139 AAA > ATA；箭头所示为突变位点 |
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图 2 野生型α珠蛋白与139赖氨酸 > 异亮氨酸突变α珠蛋白的空间结构 方框为第139氨基酸残基的位置 |
HBA2: -43 G > C突变位于α2珠蛋白基因的5’UTR中，起始密码子前第43位碱基；HBA2: c.*136 A > G突变位于α2珠蛋白基因的3’UTR中，终止密码子后第136位碱基（图 3A）。第4例标本具有--SEA杂合缺失、HBA2: -43G > C杂合突变、alpha2 +832 G- > A杂合突变和HBA2: c.*136 A > G杂合突变（图 3B），不具有-α3.7和-α4.2缺失，该标本的血红蛋白含量为125 g/L。有研究表明标准型α地贫（两个α珠蛋白基因缺失或者突变）患者的血红蛋白平均含量为114.0 g/L，HbH病（3个α珠蛋白基因缺失）患者的血红蛋白平均含量为83.3 g/L[6]。因此，HBA2: -43 G > C突变和HBA2: c.*136A > G突变均不造成α地贫。
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图 3 α2珠蛋白基因新突变测序图 A：HBA2: -43 G > C；B：HBA2: c.*136 A > G；箭头所示为突变位点 |
第10例标本的β珠蛋白基因启动子中第-99碱基（转录起始位点上游第99位碱基）和第-96碱基（转录起始位点上游第96位碱基）均具有G > A杂合突变（图 4A），没有其他点突变；血红蛋白毛细管电泳检测表明第10例标本的HbA、HbF和HbA2的占比正常（图 5A、表 3），因此β珠蛋白基因的这种双重杂合突变不造成β地贫，故将β珠蛋白基因的启动子中第-99碱基的G > A突变命名为“HBB: -99 G > A”，第-96碱基的G > A突变命名为“HBB: -96 G > A”。6例标本的β珠蛋白基因的启动子中第-62碱基（转录起始位点上游第62位碱基）具有G > A杂合突变（图 4 B）。其中第1例标本的β珠蛋白基因具有第-62碱基G > A杂合突变、HBB: c.9T > C杂合突变和IVS-Ⅱ-16 G > C杂合突变，血红蛋白毛细管电泳检测表明第1例标本的HbA和HbF的占比正常，HbA2的占比偏低（图 5B、表 3），因此该例标本具有轻度α地贫，β珠蛋白基因启动子中第-62碱基G > A杂合突变不造成β地贫，故将β珠蛋白基因启动子中第-62碱基G > A突变命名为“HBB: -62 G > A”。HBB: c.56 C > T是β珠蛋白基因第56密码子的GGC（甘氨酸） > GGT（甘氨酸）同义突变（图 4C），不影响基因功能。HBB: 3’UTR+133 G > C位于β珠蛋白基因的终止子中，3’UTR下游第133位碱基。共检测到3例HBB: 3’UTR+133 G > C杂合标本，均具有IVS-Ⅱ-654 (C- > T)杂合突变（图 4D），其他标本没有检测到IVS-Ⅱ-654 (C- > T)突变。血红蛋白毛细管电泳检测表明3’UTR+133 G > C和IVS-Ⅱ-654 (C- > T)双重杂合的第9例标本的HbA占比偏低，HbF和HbA2占比偏高（图 5C、表 3），该例标本具有β地贫。有研究表明IVS-Ⅱ-654 (C- > T)杂合突变体的HbA2占比为4.12% ~ 8.23%，HbF占比为0.30% ~ 5.54%，但是未清楚这些IVS-Ⅱ-654 (C- > T)杂合突变体的β珠蛋白基因是否具有其他突变[7]。因此尚不能判断3’UTR +133 G > C杂合突变是否造成β地贫。
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表 3 3例β珠蛋白基因新位点突变标本的血红蛋白类型和占比 |
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图 4 β珠蛋白基因新位点突变测序图 A：前为HBB: -99 G > A，后为HBB: -96 G > A；B：HBB: -62 G > A；C：HBB: c.56 C > T；D：HBB: 3’UTR +133 G > C；箭头所示为突变位点 |
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图 5 3例β珠蛋白基因新位点突变标本的血红蛋白毛细管电泳检测结果 A：第10例标本；B：第1例标本；C：第9例标本 |
地贫是世界上最常见的遗传性血液疾病，也是我国南方地区最常见的遗传病，由珠蛋白基因的缺失或者点突变造成。本研究利用基因测序法发现了珠蛋白基因网站（http://globin.cse.psu.edu/）没有记录的10种珠蛋白基因点突变——HBA1: codon 14 TGG > TGA、HBA1: IVS-I-65A > G、HBA1: codon 139 AAA > ATA、HBA2: -43 G > C、HBA2:c.*136A > G、HBB: -99 G > A、HBB: -96 G > A、HBB: -62 G > A、HBB: c.56 C > T和HBB: 3’UTR +133 G > C，在PubMed上进行文献检索也未发现这10种点突变，证实这10种点突变是首次报道。
HBA1: codon 14 TGG > TGA是不同于Codon 14 G > A的另一种α1珠蛋白基因第14密码子无义突变，造成α1珠蛋白基因丧失功能。既往研究对重庆市儿童、广西北部湾地区地贫患者、深圳市地贫患者的α1珠蛋白基因测序，均未发现HBA1: codon 14 TGG > TGA突变[8-10]。因此，HBA1: codon 14 TGG > TGA很可能是福建省龙岩市人群特有的。从15例福建省龙岩市地贫患者中检测到4例HBA1: codon 14 TGG > TGA携带者，因此HBA1: codon 14 TGG > TGA可能在该地区是常见的α地贫点突变。目前国内大部分地贫基因检测实验室所使用的α地贫检测试剂盒的检测范围为--SEA、-α3.7、-α4.2、Hb CS、Hb QS和Hb WS[10-11]。因此，有必要在福建省龙岩市地贫患者中进行大样本检测确定HBA1: codon 14 TGG > TGA的携带率，若HBA1: codon 14 TGG > TGA的携带率与Hb CS、Hb QS或者Hb WS相近或者比其更高，则对该地区的地贫患者进行基因型分析时必须增加HBA1: codon 14 TGG > TGA检测，弥补目前商品化检测试剂盒的局限性，避免漏诊、误诊，为患者提供更可靠的临床咨询依据。
HBA1: IVS-Ⅰ-65A > G是否造成α地贫有待进一步研究。虽然HBA1: codon 139 AAA > ATA不影响α珠蛋白的空间结构，但是其对α珠蛋白功能的影响需要进一步研究。血红蛋白含量检测结果表明，HBA2: -43G > C突变和HBA2: c.*136A > G突变均不造成α地贫。血红蛋白毛细管电泳检测结果表明HBB: -99（G- > A）和HBB: -96（G- > A）双重杂合突变不造成β地贫，HBB: -62（G- > A）的杂合突变也不造成β地贫。HBB: c.56 C > T是β珠蛋白基因第56密码子的同义突变，不影响β珠蛋白基因的功能。HBB: 3’UTR +133 G > C是终止子中的突变，尚不能判断3’UTR +133 G > C杂合突变是否造成β地贫。检测到的4种已知引起β地贫的突变——codon 17 (A- > T)、codons 41/42 (-TTCT)、codon 43 (G- > T)和IVS-Ⅱ-654 (C- > T)均在商业化β地贫基因检测试剂盒的检测范围内[12]。从15例福建省龙岩市地贫患者中就检测到5种α珠蛋白基因新位点突变和5种β珠蛋白基因新位点突变，表明该地区的α珠蛋白基因和β珠蛋白基因具有明显的异质性。
综上所述，本研究首次报道了10种珠蛋白基因点突变，丰富了世界珠蛋白基因突变数据库，也发现了15例福建省龙岩市地贫患者中就有4例是HBA1: codon 14 TGG > TGA携带者，值得日后进一步研究探讨。
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