长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，不编码蛋白，在生物体重要生命活动中发挥着极广泛的调控作用[1-3]。lncRNA的功能多样，最重要的作用是参与基因表达的调节。目前研究表明，lncRNA可以在启动子区通过顺式作用元件（启动子或增强子）或反式作用因子（各种DNA结合因子）调控相关基因的表达[4-5]。牙本质基质蛋白1（DMP1）是骨和牙本质特异性蛋白，在牙和颌骨的分化、成熟过程以及正确调节骨和牙本质的矿化中具有复杂而重要的作用[6-7]。DMP1基因的正常表达是骨和牙齿正常发育、钙化、干细胞向骨和牙本质分化以及正常的矿物质代谢的基础[8-9]。因此，研究DMP1基因表达调控的变化具有重要意义。本研究利用lncRNA测序技术和实时定量PCR（RT - PCR）检测孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下颌骨组织样本中DMP1基因位置附近的lncRNA的表达变化，并分析它们与DMP1基因表达的趋势。
材料与方法 一、实验动物孕18 d以及出生后2周的C57小鼠，体质量10~15 g，购自中山大学动物实验中心，饲养于中山大学（大学城）实验动物中心，饲养环境为室温20~22℃、12 h光照-黑暗循环，动物可自由取食及饮水。本研究的所有操作均遵守中山大学动物实验伦理规定。
二、主要试剂及仪器Trizol提取液和RT-PCR试剂盒均购自日本Takara公司；引物由上海生工合成；Nanodrop2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RT-PCR仪（ABI Stepone Plus）购自美国Applied Biosystems公司；lncRNA-seq高通量基因测序仪（Illumina HiSeqTM2000）购自美国Illumina公司。
三、方法 1. 取材取2只日龄为14 d的雄性C57小鼠与6只日龄为16 d的雌性C57小鼠分别合笼（雄:雌=1:3），次日通过观察雌鼠阴道栓情况确定是否受孕，受孕小鼠定义为孕1 d，以此精确记录怀孕时间获得E18D C57小鼠。对E18D（3只）以及2W（4只）小鼠逐只称重，按体质量0.01 ml/g腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠，麻醉后的小鼠固定于干冰解剖台上，于显微镜下解剖分离完整下颌骨组织，液氮速冻，保存于−80 ℃冰箱。取材完成后，采用颈部脱臼法处死小鼠，按实验动物死亡处理方式处理，麻醉及后续处理方法参考文献[10]。
2. 总RNA抽提取适量（50~100 mg）小鼠下颌骨组织样本，用研钵在液氮环境下研磨，按照试剂盒说明书步骤，分别抽提E18D及2W小鼠的下颌骨组织总RNA。对提取得到的RNA通过Nanodrop2000测定光密度值以及琼脂糖凝胶电泳检测完整性，检测合格后，其中一部分送基迪奥生物进行lncRNA-Seq高通量基因测序分析，剩余部分用于后续的RT-PCR验证分析。
3. lncRNA测序数据分析采用Illumina HiSeqTM 2000进行测序，对下机数据去除掉质量不合格的碱基序列及核糖体RNA，将得到的非编码序列与Ensemble基因组数据库进行比对。测序结果的统计分析基于泊松分布模型，根据lncRNA的表达量（RPKM值）计算该lncRNA在E18D组和2W组中的差异表达倍数[log2（2W/E18D）]，对差异检验的P值作多重假设检验校正，通过控制错误发现率（FDR）决定P值的域值，其中∣log2（2W/E18D）∣>1且FDR < 0.01的lncRNA为差异表达的lncRNA。
4. RT-PCR对E18D组和2W组样本中的DMP1基因以及在DMP1基因附近（300 000 bp以内）差异表达的lncRNA进行RT-PCR分析。取2 μg总RNA按照逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit步骤完成逆转录，取2 μl逆转录产物使用SYBR Green qPCR SuperMix反应体系，在ABI Stepone Plus系统上进行RT-PCR扩增，引物序列见表 1。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40个循环。PCR产物的特异性根据熔解曲线判定，融解曲线分析温度60 ~ 95 ℃。基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法分析，内参基因为GAPDH，E18D组的目标基因表达设置为1。每个样品均平行做3个复孔。
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表 1 RT-PCR引物序列 |
使用SPSS 22.0进行统计分析。E18D组与2W组的基因相对表达量以x±s表示，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、E18D组和2W组中差异表达lncRNA的分析通过lncRNA测序技术在E18D组和2W组中共鉴定到38 566条lncRNA，其中6 617条在E18D组和2W组样本中差异表达，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720条，RPKME18D < RPKM2W的共2 897条。
二、DMP1基因附近差异表达lncRNA的分析对6 617条小鼠颌骨不同发育时期差异表达的lncRNA在基因组的位置以及其相对DMP1基因（5号染色体，104202613-104214102，Ensemble数据库编号为ENSMOSG00000029370）的距离进行分析，在DMP1基因附近获得5条差异表达的lncRNA，见表 2。其中lnc30219和lnc17290在DMP1基因的上游，而lnc19450、lnc8282和lnc32865在DMP1基因的下游，lnc19450距离DMP1基因最近，为16 505 bp。
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表 2 DMP1基因附近差异表达的lncRNA |
DMP1基因在2W组相对表达水平低于E18D组（P < 0.05）。E18D与2W组间差异表达且位于DMP1基因附近的5条lncRNA中，lnc19450在2W组中相对E18D组的表达水平下降，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865在2W组中相对E18D组的表达水平上升（P均 < 0.05），其中lnc32865相对表达水平最高，见图 1、表 3。
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图 1 E18D组和2W组中DMP1基因及附近5条lncRNA的相对表达水平 与E18D组相比，* P < 0.05 |
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表 3 E18D组和2W组中DMP1基因及附近5条lncRNA的相对表达水平（x±s） |
lncRNA在生物体重要生命活动中发挥极广泛的调控作用[9]。大多数的lncRNA在组织分化发育过程中，具有明显的时空表达特异性、组织或细胞特异性[11]。目前对于在颌骨发育过程中起着重要作用的lncRNA未见报道，为了筛选出在小鼠颌骨不同发育时期差异表达的lncRNA，我们采用E18D和2W的C57小鼠下颌骨组织为研究材料，利用Illumina HiSeqTM2000平台的lncRNA测序技术在E18D组和2W组样本中，共检测出38 566条lncRNA。通过差异表达倍数（2倍及以上）和多重假设检验校正（FDR < 0.01）分析，共获得6 617条在E18D组和2W组样本中差异表达的lncRNA，其中RPKME18D> RPKM2W共3 720条，RPKME18D < RPKM2W的共2 897条，上述结果提示在小鼠颌骨不同发育时期差异表达的lncRNA可能在小鼠颌骨发育过程起着重要的作用。
lncRNA可以通过多种方式调节基因的转录，如通过表观遗传修饰途径包括组蛋白修饰（乙酰化、甲基化等）方式或DNA甲基化等调控基因的表达水平[12-13]。lncRNA也可以作用于启动子、转录因子，抑制下游蛋白质基因的表达；抑制目的基因转录，转录干扰等在基因转录水平进行调控[14-16]。DMP1在牙和颌骨的分化、成熟过程以及正确调节骨和牙本质的矿化中具有复杂而重要的作用，骨细胞中DMP1基因表达的时空特异性可能受非编码区的顺式调节区调控[17]。lncRNA具有时空表达特异性，并可以通过顺式作用元件调节机制调控目的基因的表达。为了筛选出可能通过顺式作用元件调节机制参与调控DMP1基因表达的lncRNA，本研究对6 617条lncRNA在基因组的位置以及其相对DMP1基因的距离进行初步分析，在距离DMP1基因300 000 bp以内区域获得5条差异表达lncRNA，分别为lnc19450、lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc 32865，其中lnc19450距离DMP1基因最近。为了对lncRNA测序的结果进行验证，本研究采用RT-PCR对DMP1基因以及5条lncRNA在E18D组和2W组样本中的表达水平进行分析。在2W组中，DMP1基因的表达水平相比E18D组降低，这一结果也与已经发表的文献报道一致[18-20]。E18D组与2W组中5条lncRNA的表达水平比较差异均有统计学意义，与lncRNA测序结果一致。lnc19450的表达与DMP1基因的表达趋势一致，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表达在2W组中上升，与DMP1基因的表达趋势相反，其中lnc32865相对表达水平最高。由此推测，lnc19450、lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表达调控中起着重要的作用，其中距离DMP1基因较近的lnc19450和相对表达水平较高的lnc32865可能与DMP1的关系较为密切。上述研究结果为进一步阐明lncRNA调控DMP1基因表达的分子机制提供了基础，在后续实验中，我们将运用过表达或小干扰RNA沉默技术，阐明相应lncRNA在过表达或抑制后DMP1的表达情况，探讨lncRNA19450或lncRNA32865对DMP1的mRNA表达的调控作用以及成骨细胞矿化作用的影响，再通过RNA结合蛋白免疫沉淀、凝胶迁移实验和启动子双荧光素实验等分析手段，揭示lncRNA19450或lncRNA32865是否通过结合DMP1基因的启动子区形成组蛋白修饰复合物的分子机制调控DMP1基因的表达，从而明确其在颌骨发育过程中的作用及相关作用机制。
| [1] |
Bassett AR, Akhtar A, Barlow DP, Bird AP, Brockdorff N, Duboule D, Ephrussi A, Ferguson-Smith AC, Gingeras TR, Haerty W, Higgs DR, Miska EA, Ponting CP. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. Elife, 2014, 3: e03058. DOI:10.7554/eLife.03058 |
| [2] |
Tuo YL, Li XM, Luo J. Long noncoding RNA UCA1 modulates breast cancer cell growth and apoptosis through decreasing tumor suppressive miR - 143. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015, 19(18): 3403-3411. |
| [3] |
Zhao W, An Y, Liang Y, Xie XW. Role of HOTAIR long noncoding RNA in metastatic progression of lung cancer. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(13): 1930-1936. |
| [4] |
Marchese FP, Raimondi I, Huarte M. The multidimensional mechanisms of long noncoding RNA function. Genome Biol, 2017, 18(1): 206. |
| [5] |
Long Y, Wang X, Youmans DT, Cech TR. How do lncRNAs regulate transcription?. Sci Adv, 2017, 3(9): eaao2110. DOI:10.1126/sciadv.aao2110 |
| [6] |
Ravindran S, George A. Dentin matrix proteins in bone tissue engineering. Adv Exp Med Biol, 2015, 881: 129-142. DOI:10.1007/978-3-319-22345-2 |
| [7] |
Jing B, Zhang C, Liu X, Zhou L, Liu J, Yao Y, Yu J, Weng Y, Pan M, Liu J, Wang Z, Sun Y, Sun YE. Glycosylation of dentin matrix protein 1 is a novel key element for astrocyte maturation and BBB integrity. Protein Cell, 2018, 9(3): 298-309. |
| [8] |
Sun Y, Lu Y, Chen L, Gao T, D'Souza R, Feng JQ, Qin C. DMP1 processing is essential to dentin and jaw formation. J Dent Res, 2011, 90(5): 619-624. DOI:10.1177/0022034510397839 |
| [9] |
Liao Q, Liu C, Yuan X, Kang S, Miao R, Xiao H, Zhao G, Luo H, Bu D, Zhao H, Skogerbø G, Wu Z, Zhao Y. Largescale prediction of long non-coding RNA functions in a coding-non - coding gene co - expression network. Nucleic Acids Res, 2011, 39(9): 3864-3878. DOI:10.1093/nar/gkq1348 |
| [10] |
邓鹏辉, 黄传君, 赵方正, 宫晓丹, 李春晓, 张才擎. TGF-β 1、VEGF在哮喘小鼠的表达及细辛脑的干预作用. 新医学, 2018, 49(1): 25-29. |
| [11] |
Ponting CP, Oliver PL, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs. Cell, 2009, 136(4): 629-641. DOI:10.1016/j.cell.2009.02.006 |
| [12] |
Schmitz SU, Grote P, Herrmann BG. Mechanisms of long noncoding RNA function in development and disease. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(13): 2491-2509. DOI:10.1007/s00018-016-2174-5 |
| [13] |
Spadaro PA, Flavell CR, Widagdo J, Ratnu VS, Troup M, Ragan C, Mattick JS, Bredy TW. Long noncoding RNA-directed epigenetic regulation of gene expression is associated with anxietylike behavior in mice. Biol Psychiatry, 2015, 78(12): 848-859. DOI:10.1016/j.biopsych.2015.02.004 |
| [14] |
Terashima M, Tange S, Ishimura A, Suzuki T. MEG3 long noncoding RNA contributes to the epigenetic regulation of epithelialmesenchymal transition in lung cancer cell lines. J Biol Chem, 2017, 292(1): 82-99. DOI:10.1074/jbc.M116.750950 |
| [15] |
Wang Y, Zhong H, Xie X, Chen CY, Huang D, Shen L, Zhang H, Chen ZW, Zeng G. Long noncoding RNA derived from CD244 signaling epigenetically controls CD8+ T-cell immune responses in tuberculosis infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(29): E3883-E3892. DOI:10.1073/pnas.1501662112 |
| [16] |
Ding G, Li W, Liu J, Zeng Y, Mao C, Kang Y, Shang J. LncRNA GHET1 activated by H3K27 acetylation promotes cell tumorigenesis through regulating ATF1 in hepatocellular carcinoma. Biomed Pharmacother, 2017, 94: 326-331. DOI:10.1016/j.biopha.2017.07.046 |
| [17] |
Thotakura SR, Karthikeyan N, Smith T, Liu K, George A. Cloning and characterization of rat dentin matrix protein 1 (DMP1) gene and its 5'-upstream region. J Biol Chem, 2000, 275(14): 10272-10277. DOI:10.1074/jbc.275.14.10272 |
| [18] |
Chen S, Chen L, Jahangiri A, Chen B, Wu Y, Chuang HH, Qin C, MacDougall M. Expression and processing of small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins in mouse odontoblastic cells. Arch Oral Biol, 2008, 53(9): 879-889. DOI:10.1016/j.archoralbio.2008.05.005 |
| [19] |
Mashhadi Abbas F, Sichani Fallahi H, Khoshzaban A, Mahdavi N, Bagheri SS. Expression of odontogenic genes in human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell J, 2013, 15(2): 136-141. |
| [20] |
Kamiya N, Takagi M. Differential expression of dentin matrix protein 1, type Ⅰ collagen and osteocalcin genes in rat developing mandibular bone. Histochem J, 2001, 33(9-10): 545-552. |